黄体酮缓释阴道环临床前药代动力学比较研究

马 彬 夏良育 杨紫霞 宁美英

1.国家卫生健康委科学技术研究所(北京，100081)；2.北京协和医学院研究生院

黄体功能不全是不孕不育的重要原因，其可导致卵发育和子宫内膜发育不同步以及孕激素下降，从而造成不孕和自然流产[1]。对于黄体支持(LPS)，临床上多采用不同剂型的黄体酮、小剂量人绒毛膜促性腺激素(hCG)等。而黄体酮安全性更高，是目前LPS的首选药物[2-3]，目前市售黄体酮主要通过口服、注射、阴道给药。黄体酮阴道制剂既可以避免口服给药的首过效应，在子宫局部发挥药效，有效减少副作用，相比于黄体酮肌内注射剂无创伤、更方便，患者依从性更优[4]。本课题组将设计出一种以乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)为载体材料的黄体酮储库型阴道环[5]用于LPS，但目前对于黄体酮阴道环用于LPS的释放剂量尚无参考标准，考虑到阴道给药制剂黄体酮凝胶制剂-雪诺同(Crinone 8%)的临床应用效果已得到认可，故以雪诺同为参比制剂，对比两者药代动力学特点，以期为处方工艺优化以及自制阴道环体外释放量的初步确定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

LC-20AD 液相色谱仪(日本岛津公司)；Triple Quad 6500三重四级杆质谱仪(美国AB Sciex 公司)；ST40R 离心机(美国Thermo Fisher 公司)；88600V -80 ℃冰箱(美国Thermo Fisher 公司)；Brand Handystep electronic连续分液器(德国Brand 公司)；96 孔板(美国AXYGEN 公司)；VG3.2涡旋振荡器(德国IKA 公司)。

1.2 材料

黄体酮原料药(含量99.7%，批号：100027-201209，中国食品药品检定研究院)；黄体酮阴道缓释凝胶(雪诺同8%，90 mg/支，批号：C18124Y/B，进口药注册证号：H20140552，美国MERCK公司)；黄体酮阴道环(1000 mg/个，自制批号：2019-12-10)；乙腈(批号：178503，美国Fisher公司)；二甲基亚砜(批号：14070312，美国TEDIA公司)；醋酸甲地孕酮原料药(内标，含量99.2%，批号：100171-201204，中国食品药品检定研究院)；甲醇(批号：WXBC2212V，美国Sigma公司)。

1.3 实验动物

巴马小型猪，普通级，23～35 kg，10～24月龄，雌性，购买于北京实创世纪小型猪饲养基地，许可证号：SCXK(京)2018-0011。

1.4 色谱条件与质谱条件

流动相A：水(含0.1%甲酸)；流动相B：乙腈(含0.1%甲酸)；采用梯度洗脱；色谱柱：Kinetex C18(50mm×3 mm，2.6 μm)；进样量：10 μl；柱温：40℃；流速：0.7 ml/min。

去簇电压(DP)：80 V(黄体酮)，60 V(醋酸甲地孕酮)；离子源：电喷雾电离源(ESI)，正离子化方式；32 V(黄体酮)，18 V(醋酸甲地孕酮)；离子源温度：600℃；离子源电压：5500 V；碰撞能量(CE)：入口电压(EP)：10 V(黄体酮)，10 V(醋酸甲地孕酮)；碰撞气压力(CAD)：10 psi；加热气压力(GS1)：60 psi；辅助气压力(GS2)：60 psi；用于定量分析的离子反应：m/z 315.2 →m/z 108.9(醋酸甲地孕酮)、m/z 385.3→m/z 325.5(醋酸甲地孕酮)；多反应离子监测(MRM)；气帘气压力(CUR)：30 psi。

1.5 体内检测方法

本实验室前期已开发出一种简单、快速的LC-MS/MS方法，并验证了该方法的有效性，适合于定量分析去卵巢型猪血浆中孕酮(PGT)[6]。见表1。

表1 测定血浆中孕酮LC-MS/MS的方法

1.6 给药方式及样品采集

在实验周期内对6只巴马小型猪进行体检，保证动物在实验周期内机体状况良好。实验周期：3d空白对照期；3d参比制剂给药期(雪诺同凝胶8%，90 mg)，每日相同时间给药1次；7d黄体酮阴道环给药期，给药1次持续7d。

采用自身对照法，在实验开始前对巴马小型猪进行去势操作，摘除子宫和卵巢，避免内源性黄体酮对实验结果的干扰。去势操作之后对巴马小型猪进行身体健康观察14d，确保恢复正常。14d后在小型猪恢复正常条件下，麻醉巴马小型猪，以K2EDTA抗凝管静脉取全血1 ml，采血3d为1周期，每日相同时间采血1次用于观察自身黄体酮浓度。当自身黄体酮未检出表明去势手术成功。

在3d参比制剂给药期间，分别将巴马小型猪麻醉后给雪诺同凝胶，并在第1天给药0 h、给药1.5 h采血(采血时间根据预实验结果)，第2，3天重复以上操作。观察小型猪健康状况，清洗7d，避免参比制剂黄体酮对后续阴道环黄体酮体内检测产生影响。

在第3阶段，将小型猪麻醉后于阴道置入自制黄体酮阴道环，给药0，6，12，24，36，48，72，96，120，144，168 h分别采血。取血浆(2 h内)并转移至离心管，储存在-20 ℃冰箱，待样品采集完毕-80 ℃保存。

1.7 临床观察

在实验周期间，观察巴马小型猪的健康状况变化(包括死亡、行为、精神、饮食、粪便性状)、动物的阴道物理状态变化。

2 结果

2.1 临床观察

去势手术后，恢复状况欠佳的有1号小型猪；除此之外，其它小型猪恢复良好。1～6号小型猪在空白样品采集过程中均无异常。1～6号小型猪在参比制剂黄体酮凝胶给药期间，第1天和第2天均无异常情况，第3天除2号小型猪的阴道有白色分泌物，其它无异常。黄体酮缓释阴道环给药期间有脱落现象，发现脱落后立即塞回阴道，阴道环置于小型猪阴道7d后统一取出。

2.2 体内黄体酮血药浓度分析结果

在去势空白对照期，测得小型猪黄体酮血药浓度均为0 ng/ml，以证明去势手术成功。在放置黄体酮阴道环前，检测小型猪血浆中黄体酮血药浓度为0 ng/ml，证明参比制剂已不会影响黄体酮阴道环的检测。各个时间点参比制剂给药期的血药浓度，如图1所示。各个时间点阴道环给药期的血药浓度，如图2所示。由药代动力学实验结果可知，1次/日，总计3日的黄体酮凝胶药代动力学参数：Cmax=10.818 ng/ml，Tmax=1.5 h，AUC0～49.5 h=327.983 ng/(ml·h)，CAVG=6.626 ng/ml；1次/7日，总计7日的黄体酮阴道环的药代动力学参数：Cmax=7.054 ng/ml，Tmax=12.0 h，AUC0～168 h=821.913 ng/(ml·h)，CAVG=4.892 ng/ml。

图1 雪诺同凝胶给药后小型猪的血药浓度曲线(n=6)

图2 自制黄体酮阴道环给药后小型猪的血药浓度曲线(n=6)

2.3 体内外相关性

同批黄体酮阴道环的数据显示：7d平均释放量(MDR)为17.906 mg，体外释放曲线的r=0.9879，近似零级释放。图3为7d内，同一批自制黄体酮阴道环体外释放结果。将黄体酮阴道环体外释放量进行零级释放方程拟合，得到体外零级释放方程累积释放量CR=14.852t+25.559，r=0.9879，7d平均每日释放量MDR=17.906 mg。6只巴马小型猪体内黄体酮平均血药浓度-时间曲线与体外释放曲线对比见图4。

图3 自制黄体酮阴道环体外释放曲线(n=6)

图4 自制黄体酮阴道环中黄体酮在体内外释放曲线

从图4可见，前3d黄体酮血药浓度均缓慢下降，但第3天体内吸收后略有升高，是因为有部分阴道环脱落，导致本应该在前几天的吸收累积在后几天。总体而言，体内吸收呈下降趋势。

3 讨论

在LPS中，黄体酮作为内源性物质可以起到保胎和稳定子宫内膜的作用[7-8]。黄体酮阴道制剂使用方便，副作用小，药效好，来自临床实践的证据表明，阴道孕酮制剂是辅助生殖技术中LPS的首选方法[9]。但是黄体酮凝胶会导致阴道出血或乳房触痛，易怒和局部发热等不良反应[10]。阴道环相对于阴道凝胶在安全性和有效性方面无差异，同时具有取放自给、无创伤、较少不良反应的优势。文献报道，阴道环材料一般采用硅橡胶[11]、EVA等[12]，目前国外已上市的产品大多采用硅橡胶，如Progering、Annovera等。硅橡胶阴道环制作复杂，且不能回收利用，易造成环境污染[13-14]。EVA是一类经美国食品和药物管理局(FDA)批准的生物材料，具有生物相容性好、机械性能好、理化性质稳定等特点，并且已有商品化的以EVA为基质的药物控制释放体系用于临床[15-17]。因此本课题组尝试以EVA为载体材料，设计出一种黄体酮阴道环用于LPS，本文针对黄体酮阴道环用于辅助生殖的释放剂量尚无参考的问题进行初步药代动力学比较研究。

在选择实验动物中，有以下几个方面的考虑：小型猪逐渐取代狗和灵长类动物被许多国家用作毒理和药理模型；此外，中国国家食品药品监督管理局宣布小型猪可以用于新化学品的临床前药代动力学研究[18-20]；小型猪遗传稳定，抗病能力强，生理学方面与人类有相似之处，这使得巴马小型猪广泛应用于医学研究，包括咽喉部反流研究以及人用药物评价等[21-23]；同时考虑到本研究为阴道给药，而常用的实验动物如大鼠、家兔等体型太小，无法置入完整的阴道环，影响实验结果的可靠性，因此选取雌性巴马小型猪，由于要排除自身体内黄体酮的干扰，本实验将小型猪去势后进行实验。但是由于本研究是第一次以巴马小型猪为动物模型开展黄体酮阴道环药代动力学的研究，阴道后穹隆处放置阴道环经验不足，导致有黄体酮阴道环脱落，但是总体趋势体内与体外释放呈现了较好的相关性，因此可以作为调整处方的科学依据。

国内外报道黄体酮阴道环的药代动力学的相关文献较少，对于黄体酮阴道环用于辅助生殖的体外释放量尚无定论。有PCT专利有报道用于治疗黄体期缺陷的一体式PGT硅橡胶阴道环，含PGT 1.8 g，7d平均体外释放量约为20.7 mg/d，可连续释放1周[24]，并对该制剂进行了药效学研究，结果显示，17d内阴道环组的平均孕酮水平CAVG为6.02 ng/ml，雪诺同组CAVG为14.18 ng/ml(90 mg，2次/d)，而阴道环组活产率高于Crinone凝胶组(60%>25%, n=5)[19]，雪诺同组的血浆水平(7.08 ng/ml, 按1次折算)与本研究中猪体内的实验结果非常接近，即CAVG为6.626 ng/ml。另一项专利描述了与上述类似的用于辅助生殖的外源性黄体酮硅橡胶阴道环，体外释放量分别是5，10，15 mg/d，在血液循环中浓度为12～15 nmol/L，即3.78～4.73 ng/ml，在进行的临床研究发现，与肌注100 mg黄体酮比较，15 mg/d阴道环组的临床妊娠率(52.9%)远高于肌注组(38.9%)，该制剂黄体酮的血浆水平与本研究中的EVA药环在猪体内的也是接近的，即CAVG为4.892 ng/ml[25]。

由以上文献结合本次实验可以初步推断出，与黄体酮凝胶相比较，本课题组所制备的黄体酮阴道环在体内血药浓度更稳定，但雪诺同凝胶的平均血药浓度(CAVG=6.626 ng/ml)高于黄体酮阴道环(CAVG=4.892 ng/ml)，说明阴道环的黄体酮释放量还需要进一步优化提高，如要达到与雪诺同相同的血药浓度，阴道环体外释放量可能在20～25 mg/d。接下来需要结合药效学进一步验证。

4 结论

采用与人结构类似的巴马小型猪为实验动物，通过已建立的LC-MS/MS法开展了自制黄体酮阴道环的体内药代动力学研究，结果显示体内外相关性良好，体外建立的方法科学可靠。以雪诺同为参比制剂，自制阴道环在体外释放量为18 mg/d，巴马小型猪体内平均血药浓度为4.892 ng/ml，初步估算黄体酮用于辅助生殖LPS的体外释放量为20～25 mg/d。本研究对于自制黄体酮阴道环的处方工艺优化及体外释放剂量确定有重要科学和实践意义。