飞行时间质谱与荧光定量法检测叶酸代谢基因多态性的比较

常 亮 任妲妮 焦利萍 刘 娟 李 乾 刘 平*

1.北京大学第三医院妇产科生殖医学中心，国家妇产疾病临床医学研究中心(北京大学第三医院)，辅助生殖教育部重点实验室(北京大学)，北京市生殖内分泌与辅助生殖技术重点实验室(100191)；2.国家卫生健康委科学技术研究所

妊娠期叶酸缺乏可导致妊娠期并发症和不良妊娠结局的发生[1-2]。叶酸代谢障碍是导致妊娠期女性体内叶酸缺乏的重要因素之一。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合酶还原酶(MTRR)是叶酸代谢通路中的两个关键酶，其基因位点的多态性会影响机体的叶酸利用能力[3]。MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G是临床上常用的叶酸代谢能力SNPs检测位点。MTRR基因A66G位点的研究较少，但其单核苷酸多态性的改变同样会影响酶的活性，导致血液中叶酸水平发生改变[4]。检测叶酸代谢通路相关基因多态性，可以更好指导妊娠期女性调整叶酸的使用剂量，避免相关妊娠期并发症和不良妊娠结局的发生。20世纪80年代出现的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术是一种软电离质谱技术[5]，具有灵敏度高、准确度高、兼容性强、通量高、样本质量要求低、成本低以及操作简便等特点[6]，在临床分子诊断方面具有极大潜力。本研究以目前临床上检测叶酸代谢能力的主流方法实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)的结果为参考，评价MALDI-TOF MS用于叶酸代谢相关基因多态性的检测，为指导备孕人群和妊娠期女性合理服用叶酸提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

随机选取2019年9月在本院生殖医学中心就诊的不孕症患者100例。研究对象要求进行叶酸代谢能力检测，收集其EDTA抗凝外周血标本，用于后续基因组DNA提取和基因多态性检测。本研究经北京大学第三医院医学科学研究伦理委员会批准(2019-431-02)。

1.2 基因组DNA 提取

使用全血基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]，取200μl全血样本进行全基因组提取。获得的基因组DNA用NanoQ评估核酸浓度和质量，取浓度20～50mg/L和A 260/280值在1.7～2.0范围内的样本进行后续实验。暂不用于实验的DNA样本保存于-20℃冰箱。操作按照试剂盒说明书。

1.3 RT-qPCR检测叶酸代谢能力

使用叶酸代谢能力测定试剂盒(荧光法，江西诺德医疗器械有限公司)检测MTHFR 677 C>T和1298 A>C。按试剂盒说明书，将荧光基团预混液加入反应体系后，按顺序加入阳性对照、阴性对照和待测样本，置于荧光定量PCR仪(罗氏cobas 480,软件版本号：LCS480 1.5.1.62 SP2.UDF V2.0.0)扩增检测。MTHFR C677T的阳性对照对应的基因型分别是纯合突变(TT)、杂合突变(CT)和野生型(CC)，A1298C的阳性对照对应的基因型分别是纯合突变(CC)、杂合突变(AC)和野生型(AA)；阴性对照为超纯水。RT-qPCR反应程序：95℃10min，激活荧光基团。95℃5s，样本变性；60℃40s，使荧光基团与样本充分结合；该过程进行40个循环。室温冷却1min，完成反应。60℃收集荧光信号，执行程序，保存文件。检测结果使用“Endpoint Genotyping”进行结果分析，将待测样本的点和对照进行比较，判读待测样本MTHFR C677T和A1298C两个位点的基因型。

1.4 MALDI-TOF MS检测叶酸代谢能力

使用MTHFR和MTRR基因检测试剂盒(PCR-飞行时间质谱法，北京毅新博创生物科技有限公司)检测。基因组DNA样本进行PCR扩增后，加入虾碱性磷酸酶消化，进行单碱基延伸反应。将延伸产物纯化后进行点样，并应用MALDI-TOF MS系统(Clin-ToF II，北京毅新博创生物科技有限公司)进行样本的相关基因型分析。

1.5 数据分析

用SPSS(IBM SPSS Statistics 22. lnk)对检测结果进行分析。对研究对象进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，各基因型频率和等位基因频率采用拟合优度χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。Kappa检验用于比较组间检测结果的一致性，Kappa值>0.95被认为具有很好的一致性。

2 结果

2.1 RT-qPCR检测结果

100例叶酸代谢关键酶MTHFR C677T和A1298C两个多态位点检测结果见图1(1541页)。纯合突变(绿色)、杂合突变(红色)、野生型(蓝色)和阴性对照(灰色)的分布如图1a(1541页)所示。根据检测点的分布，可以判读样本中MTHFR C677T位点为纯合突变(TT)、杂合突变(CT)和野生型(CC)(图 1b，1541页)；A1298C位点为纯合突变(CC)、杂合突变(AC)和野生型(AA)(图 1c，1541页)。

2.2 MALDI-TOF MS检测结果

MTHFR C677T检测的质谱图分别展示了3种基因型，即野生型(CC)、杂合突变(CT)和纯合突变(TT)(图2a，1541页)；A1298C的质谱图分别展示了3种基因型，即野生型(AA)、杂合突变(AC)和纯合突变(CC)(图2b，1541页)。MTRR A66G位点的质谱图分别展示了3种基因型，即野生型(AA)、杂合突变(AG)和纯合突变(GG)(图2c，1541页)。

2.3 RT-qPCR和MALDI-TOF MS检测结果比较

本次实验结果显示， MALDI-TOF MS与RT-qPCR对MTHFR 677 C>T、1298 A>C检测结果的符合率为100%(表1)。MALDI-TOF MS同时检测MTRR 66 A>G位点的结果为AA型50例，AG型44例，GG型6例，G等位基因频率为28.0%。Hardy-Weinberg平衡定律的检验结果验证了MTHFR 677 C>T、1298 A>C和MTRR 66 A>G位点的分离平衡性，其中MTRR 66 A>G的χ2为0.52，P为0.77。

表1 MALDI-TOF MS与RT-qPCR对MTHFR 677 C>T、1298 A>C的检测结果比较[例(%)]

3 讨论

叶酸代谢能力的评估不仅对妊娠期女性有重要意义，对其他人群，尤其是备孕的人群也重要参考意义。有研究表明，MTHFR C677T和A1298C的多态性与复发性流产的发生有关[7-9]。叶酸代谢关键酶的多态性也有可能引起男性不育[10]。此外，MTHFR基因的突变可能会引起同胱氨酸水平升高，导致高同型半胱氨酸血症，从而引起一系列疾病的发生。因此，快速准确评估叶酸代谢能力，科学指导叶酸补充，对于人群健康非常重要。

本研究采用MALDI-TOF MS检测叶酸代谢关键酶基因基因多态性位点的体系，与RT-qPCR法进行比较，二者的检测结果完全一致，说明MALDI-TOF MS检测准确度高；此外，MALDI-TOF MS法能同时完成100份样本2个叶酸代谢关键酶基因共3个SNP位点的检测，具有通量高的特点。叶酸代谢关键酶具有多个多态位点。就MTHFR而言，目前已确定的SNPs位点有20余种，其中研究得较多的有5个位点，除了长期用于临床诊断的677 C>T和1298 A>C, 还有1059T>C、1793G>A和203G>A[10]。MALDI-TOF MS具有通量高、成本低等优点，可以覆盖更多的检测位点，也能够针对不同人群选择相应的多态位点进行检测，具有广阔的应用前景。目前临床上叶酸代谢能力检测的主流方法是RT-qPCR法，该方法虽然准确度和特异性高，但是对样本质量有较高要求，RT-qPCR法每个反应需要至少20ng DNA样本量，而MALDI-TOF MS只需要10ng即可，说明后者灵敏度更高。另外，RT-qPCR法单次检测量和检测项目有限，因此成本相对较高；而MALDI-TOF MS直接检测物质的分子量，无荧光信号干扰，可一管同时扩增多个SNP位点，对于需要检测多个项目的样本而言，操作更加简便，兼容性强，单个检测项目的成本较低。本实验结果表明，MALDI-TOF MS能准确检测叶酸代谢关键酶SNPs位点。