EGFR、GPER在子宫内膜异位症组织中表达及其相关性

黄卓雅 廖鹏娟 黄楚楚 蔡敏仪 苏桂晓 王秀平 张 旻 王晓冰

广东省惠州市中心人民医院(516001)

子宫内膜异位症(EMT)。主要表现为痛经、慢性盆腔痛、不孕及性交不适[1]。虽为良性疾病但具有多次复发特点[2]。发病机制尚不明确，多数研究表明，EMT的发生与雌激素及其受体的表达调控有关[3]。表皮生长因子受体(EGFR)是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，介导细胞的生长、增殖、分化、黏附等过程，在机体生长发育中起重要作用[4]。林凤等[5]研究表明，EGFR在增生期子宫内膜、不典型增生子宫内膜、子宫内膜样腺癌中均有表达，在子宫内膜样腺癌中阳性表达显著升高。G蛋白偶联雌激素受体(GPER)是一种新型雌激素受体，与雌激素结合后参与基因调控。研究表明，GPER在卵巢子宫内膜异位症患者中高表达，且GPER表达与卵巢子宫内膜异位症的发生发展及临床分期有关[6]。然而，目前EGFR联合GPER检测在EMT中的研究报道不多。本研究探讨EGFR和GPER在EMT患者子宫内膜组织中的表达水平及其相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年1月-2020年1月在本院就诊并手术治疗的EMT患者42例，年龄(43.3±3.9)岁(28～49岁)；按美国生育协会(AFS)标准分期为Ⅰ～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期19例；增殖期15例，分泌期27例。纳入标准：①符合EMT诊断标准[7]；②经腹腔镜和术后病理确诊；③近半年内未接受过激素类药物或免疫抑制剂治疗；④临床资料完整。排除标准：①患子宫内膜癌卵巢癌；②患内分泌、代谢及免疫性疾病；③伴有子宫内膜不典型增生；④患有心脑肾等重要器官疾病。另选取同期因子宫平滑肌瘤而行全子宫切除手术31例患者作为对照组，年龄(43.6±2.5)岁(39～47岁)，并经病理诊断为正常子宫内膜，其中增殖期18例，分泌期13例。本研究经本院伦理委员会审批，患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

One Step PrimeScriptmiRNA cDNA Synthesis Kit购自宝生物工程(大连)有限公司。兔抗人EGFR购自北京中杉金桥生物技术开发公司、GPER多克隆抗体购自英国Abcam公司，SP试剂盒、DAB显色试剂盒、HRP标记的羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术开发公司。

1.3 研究方法

1.3.1样品采集及保存收集EMT患者手术后在位内膜、异位内膜组织及对照组正常子宫内膜，经生理盐水冲洗后置10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋。取部分标本提取总RNA。

1.3.2内膜组织EGFR和GPER mRNA的表达采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EGFR的表达。引物序列见表1。反应条件：95℃，75s；95℃，30s；65℃，75s；95℃，15s；共40个循环。反应结束后，采用2-△△CT分析法进行计算EGFR、GPER表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3免疫组织化学染色将石蜡标本切片，经脱蜡、高压抗原修复，加3%H2O2去除内源性酶活性，10%山羊血清37℃封闭30min，分别加入EGFR、GPER多克隆抗体(工作浓度1:200)，4℃孵育过夜，再加入二抗(工作浓度1:100)37 ℃孵育30 min，DAB染色，用磷酸缓冲液代替一抗作为阴性对照。结果判定：EGFR以细胞膜与细胞质中出现黄色或棕色为阳性，GPER以细胞膜及细胞质中出现黄色或棕色为阳性。细胞阳性率评分：随机观察5个高倍视野，每个视野计数≥100个细胞，阳性细胞数<5% 0分，5%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。根据染色强度评分，不着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。两项计分后乘积得分，0～1分阴性(-)，2～4分弱阳性(+)，5～8分阳性(++)，>9分强阳性(+++)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1内膜组织EGFR、GPER mRNA表达水平

EGFR、GPER mRNA表达水平EMT异位内膜组织与在位内膜组织无差异(P>0.05)，但均高于正常子宫内膜组织(P<0.05)。见表2。

表2 各内膜组织中mRNA表达比较

2.2 内膜组织EGFR、GPER 蛋白表达水平

免疫组织化学染色结果显示，EGFR在细胞膜与细胞质均有表达，GPER蛋白主要定位于细胞膜及细胞质中，见图1(1539页)。EGFR、GPER 蛋白阳性表达率在EMT异位内膜组织与在位内膜组织无差异(P>0.05)，但均高于正常子宫内膜组织(P<0.05)。见表3。

表3 各内膜组织EGFR、GPER 蛋白表达水平比较[例(%)]

2.3 EMT在位内膜增殖期和分泌期EGFR与GPER表达水平比较

EMT在位内膜组织中EGFR、GPER蛋白在增殖期的阳性表达率高于分泌期(P<0.05)，而正常子宫内膜组织中EGFR、GPER蛋白在增殖期与分泌期表达未见差异(P>0.05)。见表4。

表4 不同内膜组织增生期和分泌期EGFR、GPER表达水平比较[例(%)]

2.4 EMT异位内膜EGFR、GPER蛋白表达与EMT临床分期关系

异位内膜组织中，EGFR、GPER蛋白在Ⅲ～Ⅳ期阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)。见表5。

表5 EMT异位内膜EGFR、GPER蛋白表达与EMT临床分期关系[例(%)]

2.5 EMT组织中EGFR和GPER mRNA表达相关性

分析结果显示，EMT组织中EGFR、GPER mRNA表达水平呈正相关(r=0.581，P=0.000)。见图2(1539页)。

3 讨论

EMT病变广泛可发生于任何部位，具有性激素依赖的特点，能导致患者不孕及卵巢功能的破坏，具有类似低度恶性肿瘤的反复多次复发、不易切除干净等特点。因此，探讨EMT的发病机制，抑制子宫内膜腺体细胞的增殖与过度生长，对EMT的诊断治疗有重要意义[8-9]。

EGFR属酪氨酸蛋白激酶受体家族成员，在调节细胞生长、增殖及生理活动方面发挥重要作用。研究表明[10]，在子宫内膜异位症小鼠模型中，EGFR抑制剂可有效治疗子宫内膜异位病变并降低基质金属蛋白酶7(MMP-7)蛋白活性。EGFR介导的MMP-7上调在卵巢子宫内膜异位症发生发展过程中，通过ERK1-AP1轴起到促进上皮-间质转化的作用。另有研究表明，EGFR在妊娠早期调节子宫内膜功能方面发挥重要作用[11]。陶伟华等[12]研究表明，EGFR蛋白在子宫平滑肌瘤组织中表达升高，且与肌瘤数目增加、体积增大有一定关系。钮怡超等[13]研究表明，子宫平滑肌瘤剔除术后复发患者子宫肌瘤旁肌层组织EGFR阳性表达高于非复发组，提示EGFR可能与子宫平滑肌瘤复发有关。本研究结果显示，在EMT组织中EGFR蛋白表达水平高于正常子宫内膜组织，且EMT在位子宫内膜组织中增殖期EGFR阳性表达率高于分泌期，EMT异位内膜组织中III～Ⅳ期的EGFR蛋白阳性表达率高于I～II期，提示EGFR与EMT发生及分期有关。

GPER为新鉴定的雌激素受体，但又不同于经典的雌激素受体ERα和ERβ，不仅能以相对较高的亲和力与雌激素相结合，而且能触发雌激素反应。有研究表明，在子宫内膜样腺癌发生发展过程中，GPER可以调节肿瘤细胞对雌激素的反应；GPER抑制剂能有效抑制雌激素诱导的乳腺导管上皮细胞MCF-12A生长[14-15]；GPER激动剂可诱导卵巢异位的子宫内膜间质细胞有丝分裂时的细胞周期阻滞，最终导致子宫内膜异位症的细胞凋亡[16]。研究表明[17]GPER激动剂可激活EGFR信号转导通路，影响细胞增殖，可能为促进细胞增殖、减弱自身凋亡，提示EGFR与GPER可能存在相互作用。本研究结果显示，GPER在EMT组织中高表达，在位内膜组织中GPER蛋白在增殖期的阳性表达率高于分泌期，异位内膜组织中GPER蛋白在III～Ⅳ期的阳性表达率高于I～II期。提示GPER可能参与了EMT的发生发展。EMT有着类似于低度恶性肿瘤特性，本文Pearson分析显示EMT组织中EGFR与GPER表达水平呈正相关，提示EGFR与GPER可能相互作用，共同参与了EMT的发生发展。

综上所述，EMT组织中EGFR、GPER高表达，与EMT的发生及临床分期有关，二者可能在EMT的发生中存在相互协同作用。但由于本研究临床样本数据少，其在子宫内膜异位症作用机制仍需进一步研究。