肠道NDRG2参与PTSD状态下内脏高敏感作用及其机制研究*

王 静王彦钧王 悠 邓天伟 曾玮玮 梁华平 王建民 陈东风 张 健 陈阳美 杨 敏&

陆军军医大学大坪医院消化内科1(400042) 战伤感染与特需药品研究室4 武器杀伤生物效应评估研究室5 重庆医科大学附属第二医院神经内科2 重庆大学附属三峡医院消化内科3 空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室6

创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)是指突发性、威胁性或灾难性生活事件导致个体延迟出现和长期持续存在的精神障碍[1]。女性创伤暴露率为51.2%，PTSD的终生患病率为10.4%；男性创伤暴露率为60.7%，PTSD的患病率为5%[2]。既往已证实，在PTSD应激和内脏伤害性疼痛刺激下，存在广泛的内脏高敏感-痛觉敏化现象[3]。内脏高敏感是功能性胃肠病(functional gastrointestinal disorders,FGIDs)的最重要病理生理学机制。全球超过40%的人群患有FGIDs[4]，现有药物的治疗效果差，患者依从性差，目前尚缺乏阻止PTSD应激下内脏高敏感-中枢敏化发展的有效干预措施。

N-Myc下游调控基因2(N-Myc downstream-regulated gene 2,NDRG2)是2003年首次被克隆并报道的一个新抑癌基因，在不同模型和组织中发挥着截然不同的作用[5]。有研究表明，在中枢水平上NDRG2对神经病理性疼痛、炎性疼痛、心理社会应激和创伤应激反应方面发挥重要作用[5-7]。过表达NDRG2可明显影响谷氨酸转运体1(glutamate transporter-1,GLT-1)的功能活性，参与内脏高敏感-中枢敏化的形成与维持[7]。头孢曲松(ceftriaxone,CTX)是β-内酰胺类抗菌药物，可选择性诱导编码GLT基因的转录，从而特异性增加GLT-1表达，发挥抗内脏伤害性刺激的效应[8-9]。目前有关PTSD状态下肠道NDRG2参与内脏高敏感-外周敏化的作用鲜见文献报道。本研究通过制备PTSD动物模型，并分析PTSD状态下肠道NDRG2对内脏高敏感的作用以及CTX的干预作用，旨在为PTSD应激下相关内脏高敏感的FGIDs临床诊疗的研究提供新思路。

材料与方法

一、实验动物

清洁级成年Sprague-Dawley(SD)大鼠81只，体质量180～200 g；C57BL/6小鼠16只，体质量20～25 g；均由陆军军医大学大坪医院实验动物中心提供。NDRG2-/-基因敲除小鼠16只由空军军医大学(第四军医大学)基础医学院生物化学与分子生物学教研室张健教授赠送，进行鉴定后使用[10]。实验动物饲养于室温21～25 ℃的动物室，自由进食、饮水。饲养箱内铺以柔软锯末，以减少动物足底刺激。实验前严格给予12 h/12 h光控时间，适应环境1周。

二、方法

1.PTSD模型的建立：参照He等[11]的方法诱导PTSD内脏高敏感模型。将实验动物放入束缚装置中禁锢2 h；取出后放入高50 cm、直径20 cm、水深30 cm的水桶中强迫游泳20 min；游泳结束后休息15 min，再用乙醚将其麻醉至意识丧失。最后将实验动物放回饲养笼，无干扰喂养7 d，常规饮食。将SD大鼠随机分为4组：正常对照组，正常大鼠腹腔注射0.9% NaCl溶液200 mg/kg；CTX组，正常大鼠腹腔内注射CTX 200 mg/kg(Sigma公司)；PTSD组，PTSD大鼠腹腔注射0.9% NaCl溶液200 mg/kg；PTSD+CTX组：PTSD大鼠建模前后立即予CTX 200 mg/kg腹腔注射；均连续腹腔注射7 d。将小鼠分为4组：正常对照组，C57BL/6小鼠不予处理；PTSD组，C57BL/6小鼠建立PTSD模型；NDRG2-/-组，NDRG2-/-基因敲除小鼠不予处理；NDRG2-/-+PTSD组，NDRG2-/-小鼠建立PTSD模型。

2.记录电极的植入方法：参照He等[3]的研究方法，给予实验动物腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg进行麻醉，剃去实验动物右侧腹股沟和颈部皮肤的毛发并消毒，切开腹股沟韧带上方处的皮肤，将2根消毒电极的一端埋植于腹外斜肌处，两电极的间距为0.5～1 cm，针线缝合固定电极。电极另一端经皮下隧道牵引至颈部穿出并固定于背部皮肤，术后1周伤口恢复后进行实验。

3.内脏敏感性的测定：采用结直肠扩张(colorectal distention,CRD)法检测动物内脏运动反射(visceromotor reflex,VMR)[12]。造模后，实验动物用乙醚吸入麻醉，由肛门插入前端接有球囊的结直肠扩张导管。气囊末端距肛门口约1 cm，导管固定于鼠尾根部，动物置于不能转身的透明塑料笼子中。采用泰盟软件BL-420S生物机能实验系统记录在不同压力下实验动物腹外斜肌肌肉的放电活动，压力梯度分别为10、20、40、60 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，每次20 s，间隔4 min。计算平均曲线下面积(area under the curve,AUC)以定量腹壁肌电图(EMG)，并计算扩张期与基线AUC差值，以代表不同扩张压力下CRD诱导的VMR。

4.免疫荧光法：大鼠用戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔麻醉，取结肠和小肠组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，脱水透明包埋，切片，厚4 μm。切片经脱蜡至水，抗原修复；4.5% BSA封闭15 min，室温下滴加NDRG2一抗(工作浓度1∶150；英国Abcam公司)4 ℃过夜；滴加Alexa 488标记的山羊抗兔IgG(工作浓度1∶150；英国Abcam公司)37 ℃孵育1 h，PBS漂洗后加入DAPI，在荧光显微镜下观察肠道NDRG2分布和表达，Image J图像分析系统测定NDRG2的相对表达量。

三、统计学分析

结 果

一、NDRG2-/-基因敲除小鼠的内脏高敏感改变

CRD压力为40、60 mm Hg时，与正常对照小鼠相比，PTSD小鼠VMR显著增加(0.213±0.004对0.199±0.006，P=0.033；0.327±0.005对0.309±0.005，P=0.021)，NDRG2-/-小鼠VMR显著降低(0.185±0.002对0.199±0.006，P=0.023；0.287±0.005对0.309±0.005，P=0.005)；而压力为10、20 mm Hg时，PTSD小鼠和NDRG2-/-小鼠内脏敏感性与正常对照小鼠相比差异无统计学意义(P>0.05)。CRD压力为40、60 mm Hg时，与PTSD小鼠相比，NDRG2-/-小鼠VMR显著降低(0.185±0.002对0.213±0.004，P=0.000；0.287±0.005对0.327±0.005，P=0.000)；NDRG2-/-+PTSD小鼠VMR显著降低(0.197±0.004对0.213±0.004，P=0.015；0.303±0.005对0.327±0.005，P=0.002；图1)。

*与正常对照组比较，P<0.05；#与PTSD组比较，P<0.05

二、PTSD大鼠模型内脏敏感性的改变

CRD压力为40、60 mm Hg时，与正常对照大鼠相比，PTSD大鼠VMR显著增加(0.681±0.022对0.570±0.024，P=0.003；0.842±0.033对 0.670±0.016，P<0.001)，CTX组VMR显著降低(0.483±0.018对0.570±0.024，P=0.022；0.569±0.021对0.670±0.016，P=0.012)；而CRD压力为10、20 mm Hg时，PTSD组、CTX组与正常对照大鼠相比无明显差异(P>0.05)。压力为40、60 mm Hg时，与PTSD组相比，PTSD+CTX组的VMR显著降低(0.566±0.035对0.681±0.022，P=0.003；0.680±0.029对0.842±0.033，P<0.001；图2)。

*与正常对照组比较，P<0.05；#与PTSD组比较，P<0.05

三、各组大鼠肠道NDRG2表达

免疫荧光分析显示NDRG2主要分布于肠道上皮细胞、黏膜下神经丛和肌间神经丛(图3、图4)。与正常对照组相比，CTX组大鼠结肠NDRG2表达显著降低(93.390±2.411对105.750±2.306，P=0.001)，PTSD大鼠NDRG2表达显著上升(115.127±3.062对105.750±2.306，P=0.007)。与PTSD组相比，PTSD+CTX大鼠NDRG2表达显著降低(98.840±2.082对115.127±3.062，P<0.001)。

讨 论

内脏高敏感主要表现为痛觉过敏、痛觉超敏、自发痛等反应性增强或敏化过程，对疼痛和不适的阈值明显降低，呈多部位、弥漫性分布，易被正常或异常刺激因子激惹，当存在心理压力和症状恶化时高敏感性可增强[13-14]。既往研究表明，在PTSD应激状态下，存在广泛的内脏高敏感-痛觉敏化现象，如PTSD后FGIDs、跨器官敏化相关疾病的发生率呈上升趋势，PTSD应激可触发或加重FGIDs患者的临床症状[15]。

既往研究[16]表明，在炎症和氧葡萄糖剥夺/再氧合状态下，NDRG2不同片段可从胞质移至胞核内，诱导细胞凋亡和细胞结构的改变，并在维持肠道稳态、结肠炎及其相关肿瘤发展中起有重要作用。利用NDRG2-/-基因敲除小鼠建立的葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎模型证明NDRG2在维持肠道稳态和结肠炎相关肿瘤的发展中起有重要作用，推测肠道NDRG2在PTSD内脏高敏感形成中亦发挥了重要作用[17]。既往有关PTSD应激状态下痛觉敏化/去敏感的研究主要聚焦于中枢神经系统，其在肠道水平的分子机制尚不完全清楚。本研究结果显示，NDRG2-/-基因敲除小鼠对伤害性内脏刺激，即在40 mm Hg、60 mm Hg压力下行CRD时内脏敏感性显著降低；同时NDRG2-/-基因敲除的PTSD小鼠内脏敏感性较PTSD小鼠亦显著降低，提示NDRG2可能参与了PTSD内脏高敏感的调控作用。

NDRG2是1999年首次发现的一个新基因[18]。该基因编码一个由371个氨基酸组成的大小为40.7 kDa(1 Da=0.992 1 u)的蛋白，具有α/β水解酶催化结构域。Myc通过与NDRG2基因的核心启动子区相互作用来抑制NDRG2的转录。NDRG2是一种应激反应基因，在心理社会应激和创伤的应激反应方面发挥重要作用，在细胞增殖、分化和肿瘤发生、转移中亦发挥作用[19]。Zhang等[16]的研究表明，NDRG2在肠道水平主要表达于肠神经系统的胶质细胞，在炎症刺激和氧葡萄糖剥夺/再氧合暴露状态下，NDRG2表达参与肠道炎症和缺血/再灌注损伤的发病机制。Shen等[20]的研究结果表明，NDRG2在肠上皮细胞中表达并调节肠上皮细胞分化。NDRG2在脊髓星形胶质细胞中特异性表达并参与神经痛作用。Cheng等[7]的研究发现，在神经痛动物模型鞘内注射NDRG2-RNAi腺病毒抑制NDRG2表达后，可明显缓解脊神经结扎诱发的机械和热超敏反应，提示NDRG2在脊髓水平参与了神经性疼痛的形成和维持，可能成为一种新颖的治疗神经痛的靶标。然而，NDRG2在肠道水平参与应激相关的内脏高敏感的作用和机制鲜见文献报道。本研究表明，PTSD大鼠模型肠道NDRG2表达较正常对照组显著增高，CTX干预可明显下调PTSD大鼠、正常对照大鼠肠道NDRG2表达，同时CTX干预后PTSD大鼠的内脏敏感性显著降低。提示CTX干预可通过下调NDRG2表达发挥抗内脏伤害性刺激的作用。

A：正常对照组；B：PTSD组；C：CTX组；D：PTSD+CTX组

A：正常对照组；B：PTSD组；C：CTX组；D：PTSD+CTX组

有研究发现，NDRG2-/-小鼠表现为运动亢进和细胞外液谷氨酸增多[21]，NDRG2可通过GLT-1对高浓度谷氨酸的摄取来降低细胞外液谷氨酸的浓度，提示在PTSD状态下NDRG2可能通过GLT-1和谷氨酸参与内脏高敏感的机制。本研究的前期研究[9]亦证实在PTSD状态下，CTX可通过选择性诱导编码GLT-1基因的转录而上调GLT-1的表达。另有研究表明，NDRG2敲除小鼠中STAT3表达降低，过表达NDRG2能激活STAT3，而JAK/STAT3与GLT-1功能活性异常有关[22]。因此，推测在PTSD内脏高敏感状态下，CTX干预不仅可通过上调GLT-1表达发挥抗内脏伤害性刺激的作用，还可通过抑制NDRG2-JAK/STAT3信号通路共同发挥作用，为丰富肠道神经系统的肠神经胶质细胞的NDRG2-JAK/STAT3-GLT-1信号通路调控PTSD内脏高敏感和外周敏化的理论脉络提供了科学依据，NDRG2可能是干预PTSD内脏高敏感的新的分子靶标。未来将进一步探究NDRG2在中枢水平调控PTSD内脏高敏感的作用及其分子机制。

总之，本研究表明PTSD状态下，NDRG2在肠道水平参与了内脏高敏感及其外周敏化的调控，揭示了CTX通过下调NDRG2表达发挥抗内脏伤害性刺激作用的新机制，从而为应激相关的内脏高敏感的干预以及FGIDs的临床诊疗奠定了实验基础。