ARB和ACEI对裸鼠人子宫内膜癌移植瘤生长影响

王路祎,张月华,张鑫,刘情,石海燕

(佛山市第一人民医院病理科,广东佛山 528000)

子宫内膜癌(EC)是妇科常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年增高[1]。EC 病人血管紧张素Ⅱ受体1(AT1R)阳性群体的无病生存期明显缩短[2]。乳癌组织中AT1R 的阳性率为48%,与腋淋巴结转移呈正相关,表明AT1R 可能和肿瘤转移有关[3]。另外,血管紧张素转换酶(ACE1)在EC 中上调,且与肿瘤细胞的恶性生物学行为密切相关[4]。ACE1抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)均可抑制肿瘤细胞生长和血管内皮生长因子(VEGF)介导的血管生成,并促进凋亡和坏死[5-7]。然而,ACEI和ARB对EC移植瘤生长的影响仍不清楚。为此,我们建立了裸鼠EC 移植瘤模型,分别使用ARB(氯沙坦)和ACEI(卡托普利)进行灌胃干预,以确定二者是否可抑制EC移植肿瘤的生长。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 人EC样本收集 2017年1月—2019年3月,从我院接受手术的病人中获得18例EC组织和相邻的正常组织,置于-80 ℃液氮中保存。本研究经我院医学伦理委员会批准,参与者均知情同意。

1.1.2 细胞系与试剂药品 人EC 细胞株HEC-1-B,购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。卡托普利购于中美上海施贵宝制药有限公司。氯沙坦购于杭州默沙东制药有限公司。TRIzol试剂购于美国英杰公司;ACE1 抗体(ab75762)、AT1R 抗体(ab124505)、VEGF-A 抗体(ab46154)、CD34单克隆抗体(ab81289)均购于美国Abcam 公司。TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购于凯基生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ACE1和AT1R基因表达 使用TRIzol试剂从组织样品中提取总RNA,使用Reverse Transcription试剂盒(Takara,Dalian,China)进行逆转录反应和cDNA合成。用SYBR-Green Real-Time Master Mix(日本)进行RT-qPCR 分析,检测ACE1和AT1R基因表达。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照基因进行结果标准化。PCR 所用引物及其序列见表1。在Applied Biosystems 7500 序列检测系统(美国,ABI公司)上进行qPCR 和数据收集。

表1 PCR 所用引物及其序列

1.2.2 MTT 实验检测HEC-1-B 细胞的增殖 将HEC-1-B细胞悬液按每孔100μL 加入到96孔板,分为3组(对照组,A 组;ARB 组,B 组;ACEI组,C组),其中ARB 组用移液枪在实验孔每孔加10μg(100μL)的ARB,ACEI组每孔加10μg(100μL)的卡托普利,对照组加100μL 的DMEM 培养基,均设3个复孔。置37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养16 h后,加入20μL的MTT(5 g/L)继续培养4 h,弃上清,加入150μL的DMSO,37℃振荡10 min,使用MK3 酶标仪(美国赛默飞)测定490 nm 波长处吸光度。

1.2.3 动物移植瘤模型制作 取雌性4～6 周龄BALB/c裸鼠30只(体质量15～18 g),购自北京维通利华实验动物有限公司,饲养于佛山市第一人民医院病理科SPF级动物房内。将HEC-1-B 细胞株(3×107)皮下植入每只裸鼠的腹侧。将小鼠分为3组,每组10只,分别为对照组(A 组)、ARB 组(B组)和ACEI组(C组)。从细胞植入之日起,除正常饮食外,对照组每天胃饲生理盐水0.5 m L,ARB 组每天胃饲10 mg/kg氯沙坦0.5 m L,ACEI组每天胃饲10 mg/kg 卡托普利0.5 m L。分别于7、14、21、28、35 d称体质量后,以断颈法处死动物并完整剥离体内所有肿瘤包块,精确测量包块的体积。将35 d动物剥离肿瘤标本部分用无水乙醇保藏并放液氮速冻备用,部分用40 g/L甲醛固定。所有动物实验均符合实验动物操作规范且经我院动物伦理委员会审查和批准。

1.2.4 肿瘤组织免疫染色 将甲醛溶液固定的组织切片(厚度5μm)与抗CD34 单克隆抗体(1∶300)在4 ℃孵育过夜。加入生物素二抗,将标本组织与抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物孵育,并用二氨基联苯胺显色。洗涤后,将载玻片用100 g/L苏木精复染1～2 min。

1.2.5 微血管密度(MVD)评估 肿瘤组织常规切片后,每组标本各取一张坏死组织最少、肿瘤细胞丰富的切片,首先在低倍光学显微镜下寻找内皮细胞染色(CD34标记)最密集的10个区域(形成微血管最丰富的区域),然后在高倍光学显微镜下观察组织微血管数目。计算每个视野的数目,取平均值,即为每个高倍视野下的MVD。

1.2.6 蛋白免疫印迹检测 收集各组小鼠肿瘤组织,以TRIzol法提取总蛋白,经过SDS-PAGE 电泳分离蛋白质,并转移到PVDF 膜,分别用VEGF-A的一抗和对应的二抗孵育PVDF 膜,随后用电化学发光液进行显色。使用Image J软件分析蛋白灰度值。分别计算观察组和对照组VEGF-A 的相对表达量,结果以VEGF-A 灰度值/GAPDH 灰度值的比值表示。

1.2.7 细胞凋亡检测 使用凯基KGA 7062一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒检测细胞凋亡,严格按照试剂盒的说明进行检测。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 EC组织中AT1R 和ACE1 的m RNA 和蛋白表达

RT-qPCR 检测的结果表明,与癌旁组织相比较,子宫内膜癌组织中AT1R和ACE1的mRNA表达水平均明显升高,二者差异均有统计学意义(t=8.298、9.032,P＜0.05)。见图1A、B。蛋白免疫印迹检测的结果表明,与对应的癌旁组织相比较,子宫内膜癌组织中AT1R 和ACE1的相对蛋白水平均显著升高,差异均有统计学意义(t=39.631、64.313,P＜0.05)。见图1C。提示AT1R 和ACE1在子宫内膜癌组织中表达上调。

图1 EC组织和癌旁组织AT1R 和ACE1 的mRNA和蛋白表达

2.2 ARB和ACEI作用不同时间对HEC-1-B细胞移植瘤生长的影响

对照组HEC1-B细胞的相对增殖活性为1.000±0.004,ARB组为0.511±0.081,ACEI组为0.425±0.079,ARB 组和ACEI组的细胞增殖活性均显著低于对照组(t=10.444、12.591,P＜0.05)。对照组随着时间增加,肿瘤体积持续增加,差异具有统计学意义(F=245.324,P＜0.05);ARB 组随着时间增加,肿瘤体积也增加,但是速度放缓,差异具有统计学意义(F=89.115,P＜0.05);ACEI组在不同时间点的肿瘤体积的差异无统计学意义(F=3.264,P＞0.05)。分别与21、28、35 d的对照组比,ARB 组的肿瘤体积均降低(t=9.534～13.226,P均＜0.05),ACEI组的肿瘤体积也均降低(t=11.798～12.503,P均＜0.05)。而在7 d和14 d,ARB和ACEI对肿瘤体积的抑制作用不明显(t=1.330、2.109,P均＞0.05)。见图2a。对照组、ARB 组和ACEI组不同时间点的组内体质量比较,差异均无统计学意义(F=2.186～4.321,P均＞0.05)。与对照组相比较,ARB组和ACEI组小鼠的体质量在各个时间点(7、14、21、28、35 d)均无变化,差异均无统计学意义(t=1.072～2.676,P均＞0.05)。见图2b。

图2 ARB和ACEI对不同时间EC移植瘤小鼠肿瘤体积和体质量的影响

2.3 ARB和ACEI对EC移植瘤血管生成的影响

实验结果表明,对照组中肿瘤微血管增生明显,而且ARB 组和ACEI组的MVD 均显著低于对照组,差异均有统计学意义(t=10.944、11.563,P＜0.05)。见图3A～C。与对照组比较,ARB 组和ACEI组的VEGF-A 表达均明显下调,差异均有统计学意义(t=11.523、12.076,P＜0.05)。见图3D。

图3 ARB和ACEI对EC移植瘤MVD和VEGF-A表达的影响

2.4 ARB和ACEI对EC移植瘤细胞凋亡的影响

与对照组相比,ARB组和ACEI组的肿瘤凋亡指数均明显增加,差异均有统计学意义(t=12.209、14.782,P＜0.05)。见图4。

图4 ARB和ACEI对EC移植瘤细胞凋亡的影响

3 讨 论

本文研究结果表明,ARB 和ACEI在EC 细胞小鼠异种移植模型中具有抗肿瘤作用。ARB(氯沙坦)和ACEI(卡托普利)的有效剂量和给药方案均根据以往的研究和我们前期的研究结果而确定[8]。在本研究中,给药后小鼠体质量变化不显著,表明ARB和ACEI的使用可能没有引起较强的细胞毒性。而且,从本研究结果来看,无论ARB或ACEI,二者对EC细胞移植瘤生长的抑制程度基本一致。另外,本研究结果显示ARB和ACEI可能通过抑制小鼠EC细胞移植瘤的血管生成和促进凋亡来抑制肿瘤的生长。

VEGF是调节血管生成的最重要的细胞因子。EC的关键特征是相对于正常子宫内膜组织VEGF表达上调[9]。VEGF是EC和其他多种癌症的重要预后因素,而且药物抑制肿瘤生长往往同时伴随着VEGF 表达的明显降低[10]。MANENTI 等[11]报道,顺氯氨铂可抑制人卵巢癌小鼠移植瘤模型中的肿瘤生长,并且与血浆中VEGF 的显著降低有关。本研究使用人EC 细胞系HEC-1-B 制备的移植瘤模型可以自发产生多种细胞因子,包括VEGF[12],本研究中观察到ARB 和ACEI均能够明显抑制HEC-1-B移植瘤肿瘤标本中VEGF的表达。

本文结果还显示,ARB和ACEI可明显抑制肿瘤血管生成。已知血管紧张素Ⅱ与血管紧张素转移酶均和血管生成因子(包括VEGF)的分泌有关,并且血管紧张素Ⅱ受体的阻断被认为通过抑制VEGF分泌和血管生成来抑制肿瘤的生长[13]。多项研究证明,ARB 和ACEI均能够通过抑制VEGF 对肾癌[14]、膀胱癌[15]、前列腺癌[16]等发挥抗血管生成作用。本文结果也表明,ARB和ACEI同样可以抑制EC细胞移植瘤的血管新生,这与二者在多种肿瘤细胞移植瘤的血管新生过程中发挥负调节作用的报道一致[17-18]。然而,由于移植瘤模型的实验局限性,并不能明确人类VEGF 在多大程度上可影响移植瘤中微血管的生成。

本文研究结果还表明,ARB和ACEI可以促进EC细胞在体内的凋亡。FUJIMOTO 等[19]的研究结果显示,ARB对胰腺癌具有抗增殖作用,ACEI对胃癌增殖也具有抑制作用[20]。TAN 等[21]报道,氯沙坦能够降低大鼠神经胶质瘤的有丝分裂指数和细胞增殖。本文结果则显示,ARB和ACEI的抗肿瘤作用不仅表现为抗细胞增殖和抗血管生成,而且还能增强肿瘤细胞凋亡。但其具体机制需要更深入的研究,并且应该进一步的研究ARB和ACEI的抗肿瘤侵袭性作用。

综上所述,本文研究结果证明ARB和ACEI对EC肿瘤生长和血管生成均有潜在的抑制作用。本文研究结果为进一步深入探讨靶向血管紧张素Ⅱ受体和血管紧张素转换酶对EC肿瘤治疗作用提供了实验基础。