干细胞旁分泌效应在缺血性心脏病中的研究进展

向祖金 张 静 杨 简

(三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 心血管内科 & 三峡大学 心血管病研究所 & 湖北省缺血性心血管疾病临床医学研究中心， 湖北 宜昌 443003)

中国心血管病患病率及病死率近年来持续攀升，其中缺血性心脏病病死率每年以5.05%的幅度持续上升，已成为继中风后第二大死亡病因[1]。缺血性心脏病往往伴随心肌细胞死亡、心脏功能退化，最终进展为心力衰竭。完全恢复晚期心力衰竭患者心功能的唯一方法是心脏移植，但由于供体短缺，心脏移植常常受到限制。干细胞具有多向分化潜能，近年研究表明，干细胞的心脏谱系分化潜能较低，其心脏保护及心肌修复作用大多是通过旁分泌多种物质实现[2]。目前认为干细胞的旁分泌效应可能是治疗缺血性心脏病的有效策略，本文就干细胞旁分泌效应及其主要机制作一综述。

1 干细胞旁分泌效应的概述

干细胞是一种具有自我更新能力、低免疫原性和多谱系分化潜能的特殊细胞，按发生学来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞，按不同分化潜能可分为全能干细胞、多能干细胞及单能干细胞。然而，将干细胞暴露于各种心源性刺激，均不能实现其大量向心脏谱系分化的目标[3]。一直以来，干细胞的心脏保护效应未获得合理解释。

直到2004年，Kinnaird等[4]首先提出了移植干细胞以旁分泌效应发挥作用的概念，他们发现骨髓来源的基质细胞可向培养基中释放血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，且单独向大鼠缺血心肌输注这些细胞因子可提高心肌存活率、增加梗死周围区微血管密度及提高左室射血分数。随后，部分学者提出了“药用信号细胞”一词，以解释骨髓间充质干细胞整合到损伤心肌部位，并分泌具有药理或组织修复活性相关因子的现象[5]。这种旁分泌效应随后也经一系列体内外研究证实，被学界广泛接受，认为这是多种干细胞改善心功能的主要方式。Roura等[6]发现，脐带血间充质干细胞尽管无显著的心肌分化潜能，但在体内外均可显著促进血管新生，修复部分受损心肌，一定程度改善心功能。另外，Tang等[7]研究显示，尽管移植细胞不能分化为心肌细胞，但干细胞分泌的某些物质却可显著延长心脏祖细胞在靶部位的存活时间，从而整体提高移植效率。

2 干细胞旁分泌效应在缺血性心脏病治疗中的重要介质——外泌体

旁分泌效应是干细胞发挥作用的主要模式，一种直径40～100 nm的细胞衍生性囊泡样小体是其关键介质，并广泛参与各种细胞间通讯，这种小体被称为“外泌体”。外泌体可由包括干细胞在内的多种细胞分泌，并通过内含的各种载体(如RNA、脂质或蛋白质)发挥多种生物学作用[8]。

干细胞分泌的外泌体可被局部转运至功能障碍心肌而发挥心脏保护作用。Arslan等[9]发现，与对照组相比，给严重缺血小鼠心肌局部注射间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)分泌的外泌体，可显著减小心肌梗死面积并减轻心室重构，改善心功能。因此，我们合理地推测，外泌体可作为干细胞旁分泌效应中的关键介质而发挥心脏保护效应。除上述心脏保护特性外，干细胞来源外泌体也显示出较强的可塑性，从而拓展了干细胞通过旁分泌效应治疗缺血性心脏病的范畴[10]。一方面，它们可能被用作理想的药物传递载体，而且可以通过干细胞在体外大量生产；另一方面，外泌体可在体外经过合理的修饰后高效传递心脏特异性保护因子[11]。

上述结果显示，外泌体在缺血性心脏病的干细胞治疗中发挥关键作用，然而其具体作用机制目前仍未阐明。Arslan等[9]发现MSCs来源的外泌体被注入缺血再灌注心肌后，心肌组织内ATP及还原型辅酶水平升高，局部心肌氧化应激反应减轻，局部及全身炎症水平降低。Liu等[12]发现，脐带血间充质干细胞来源的外泌体在H9C2缺氧/复氧模型中，通过激活PI3K/Akt/mTOR通路发挥抗凋亡作用。为了充分利用干细胞来源外泌体介导相应治疗，需要进一步研究来阐明其具体作用机制。

3 干细胞旁分泌在缺血性心脏病治疗中的主要效应物质

3.1 细胞因子

生长因子是参与多种细胞生物学过程的重要信号分子，其含量在多种干细胞治疗前后可发生显著变化，因此被认为是干细胞旁分泌的主要效应物质。Tachibana等[13]发现，诱导多能干细胞及其来源的心肌细胞、人胚胎干细胞及其来源的心肌细胞培养基上清液中，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白介素(interleukin，IL)-8、粒细胞集落刺激因子含量减低，血管内皮生长因子含量增加，从而抑制炎症反应，促进血管生成，加速细胞增殖并抑制细胞凋亡，这可能是心梗后心功能恢复的主要机制。此外，脂肪间充质干细胞也可产生血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和转化生长因子-β，促进血管新生，抑制细胞凋亡，从而发挥心肌保护作用[14]。

然而，这些在动物实验及细胞实验中有益的部分生长因子，却未在临床试验中获得满意疗效。例如，血管内皮生长因子是一种常见的促血管生成因子，在急性心肌梗死动物模型中，可以改善局部心肌血流灌注并在一定程度恢复心功能，但其在临床研究中，与安慰剂组比较，输注血管内皮生长因子的心肌梗死患者，心功能未见明显改善[15-16]。同样，心肌特异性过表达成纤维细胞生长因子-2可提高梗死小鼠的心功能，减少心肌梗死面积，但随后临床研究显示，成纤维细胞生长因子-2对缺血性心脏病患者的心脏保护作用甚微[17-18]。这可能是由于治疗性生长因子的移植效率低和/或生长因子的半衰期短，尽管早期表现出一定心脏保护效应，但后期随着生长因子逐渐耗竭，部分患者心功能反而恶化。

3.2 miRNA

除了各种细胞因子，miRNA也是干细胞旁分泌的重要效应物质。miRNA是一类高度保守的、单链小分子非编码RNA，通过与靶基因3’端非翻译区互补配对，调节转录后的基因表达。miRNA广泛参与心肌细胞发育和心血管疾病进程。心肌梗死后，多由于心肌细胞再生不足导致心力衰竭，因此，促进心肌细胞增殖是恢复心功能的关键。Borden等[19]发现过表达miR-294可通过Wee1/CyclinB-CDK1信号通路使成年小鼠损伤心肌细胞周期重启，从而促进心肌细胞增殖，加速损伤心肌修复，减少心肌损伤面积，进而改善心功能。miR-590-3p 也可通过心肌细胞内吞，促进梗死周围心肌细胞增殖，最终改善心功能[11]。

miRNA被发现在多种干细胞外泌体中富集，并介导缺血性心肌的保护作用。MSC来源外泌体内富集的miR-21a-5p，可通过下调凋亡相关蛋白4抗原、人凋亡相关因子配体等促凋亡基因，减少缺氧心肌细胞凋亡[20]。CD34+干细胞群能分泌富含miR-126-3p的外泌体，直接作用于缺血小鼠血管内皮细胞，通过抑制靶基因SPRED1的表达来促进血管生成[21]。人骨髓间充质干细胞分泌的miR-21-5p可能通过PI3K信号通路，调节心肌收缩力和心肌细胞钙处理水平，从而改善心功能[22]。心肌祖细胞衍生的外泌体内也有多种促进心肌细胞增殖和血管生成的miRNA富集，如miR-132、miR-210和miR-146等[23]。这些均表明干细胞可通过旁分泌各种miRNAs在缺血性心脏病中发挥治疗潜力。

3.3 其他

除了细胞因子及miRNA外，近年来，干细胞来源外泌体内部的脂质、蛋白质也被证明是干细胞通过旁分泌效应发挥心脏保护作用的重要物质[8]。Arslan等[9]研究表明，外泌体来源的多种酶也可提高缺氧小鼠心肌细胞能量代谢率，改善心肌细胞缺氧状态，减少心肌细胞凋亡。相信随着研究深入，其他发挥心肌保护作用的旁分泌物质也会相继被发现。

4 干细胞旁分泌效应在缺血性心脏病治疗中的主要挑战

干细胞一度被认为具有分化为心肌细胞从而替代梗死心肌的潜力，但多年来并未被证实。后来，其旁分泌效应被逐渐揭示，并显示出心脏保护潜力，但仍有较多因素限制其转化应用。

首先，干细胞很难在靶部位高效保留。为了增强受损心肌对治疗性生长因子的捕获，有学者试图利用生物支架材料，使这些细胞因子能够在靶部位持续释放。Garbayo等[24]在猪心肌梗死模型中，将神经调节蛋白加载到特殊微粒中，可使治疗因子在局部持续释放，从而促进血管生成，减少心室重构，改善左心室功能。部分特殊载体也可增强干细胞移植效率。Wang等[25]将水凝胶-miR-302复合物单次注入心肌梗死小鼠心脏，可观察到心肌细胞的持续增殖和心脏功能的改善。此外，改良的基因疗法也提高了旁分泌效应物质的移植和表达效率。Shan等[26]发现，用生长抑制特异性基因6修饰MSC，可增强PI3K/Akt信号通路转导，以旁分泌方式提高缺氧诱导因子-1等细胞因子在缺氧条件下的分泌，从而提高心肌梗死大鼠的心肌细胞存活率，减少心肌梗死面积，改善心功能。

其次，干细胞发挥生物学效应不仅取决于干细胞本身的质量，还取决于良好的移植微环境。近年来，各种着力于移植微环境的研究相继展开。心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)在梗死区微环境中高表达，Wang等[11]利用基因转染技术在MSC表面表达一种cTnI靶向的短肽，获得cTnI靶向外泌体，这些外泌体可沿着cTnI浓度梯度定位于梗死区域，从而将其携带的miR-590-3p高效传递至心肌梗死区发挥心肌保护作用。Yang等[27]在干细胞治疗心梗的临床试验中发现，在干细胞移植前3天～后4天给予每晚1次80 mg阿托伐他汀强化治疗后，患者射血分数提高了12.6%，而单用阿托伐他汀治疗组仅提高了5%。这提示在干细胞治疗同时联合其他治疗途径，可能改善干细胞移植前后心肌微环境，提高干细胞治疗成功率。

5 总结与展望

干细胞旁分泌效应是干细胞治疗的重要方式，参与旁分泌效应的各种细胞因子、miRNA、脂质及蛋白质可以通过外泌体等介质在靶部位保留，从而促进心肌细胞及心肌间质细胞增殖，抑制细胞凋亡，抑制炎性反应及免疫损伤，从而发挥心脏保护作用。同时，外泌体作为旁分泌效应的关键介质，从培养的干细胞中分离提纯并用于缺血性心脏病的治疗，意味着“无细胞干细胞治疗时代”的到来。然而旁分泌效应物质能否在靶部位高效保留并持续释放仍是最大技术瓶颈。另外，除干细胞本身因素需重点考虑外，还应注重移植微环境的改善，综合考虑以期提高干细胞的治疗效果。