牛膝不同炮制方法不同商品等级饮片中有害残留物含量比较*

张 慧，闫梦真，张振凌，4，陈祎甜，刘 爽

（1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南省中医院，河南 郑州 450046；3.河南省中药特色炮制技术工程研究中心，河南 郑州 450046；4.呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450046）

牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，味苦、甘、酸，性平，归肝、肾经，具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行的功效，用于治疗经闭、痛经、腰膝酸痛、筋骨无力、淋证、水肿、头痛眩晕、牙痛、口疮、吐血、衄血[1]。具有抗肿瘤、抗骨质疏松、抗炎、提高免疫力等药理作用[2-6]。随着中国工业的快速发展，中药污染问题受到人们越来越多的关注，中药中的重金属、农药残留、黄曲霉毒素等有害残留物对人类健康的影响已受到国内和国际上的普遍重视。《中华人民共和国药典》（2015年版）及《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》[7]对铅、镉、砷、汞、铜等重金属，农药残留，黄曲霉毒素作出了限量规定。牛膝等级分类较为繁杂，但整体分类大致相同[8-9]，参考团体标准T/CACM 032.58－2017《中药材商品规格等级牛膝》及市场调研，根据直径大小将牛膝分为4个等级。一等：0.8 cm＜d；二等：0.6 cm＜d≤0.8 cm；三等：0.4 cm＜d≤0.6 cm；统货；酒牛膝不分等级。查阅文献，未发现关于牛膝不同等级饮片中有害残留物差异的研究，《中华人民共和国药典》2015年版未对牛膝不同等级饮片有害残留物作出限量规定。因此，本研究对牛膝不同炮制方法不同商品等级中重金属、农药残留及黄曲霉毒素进行测定，参考《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》及《中华人民共和国药典》（2015年版）有关限量标准进行评价，比较牛膝不同等级饮片间、牛膝与酒牛膝间含量差异，探讨有害残留物在牛膝等级、不同炮制品间的分布规律，为牛膝不同等级饮片与酒牛膝质量分级和质量评价提供参考依据。

1 实验材料

1.1 仪器三重四极杆液质联用仪（TSQ Quantis，赛默飞世尔科技有限公司）；氮吹仪（HSC-12A，天津恒奥科技发展有限公司）；气相色谱质谱联用仪（Thermo Fisher）；电感耦合等离子体质谱仪（iCAP-Qc，赛默飞世尔科技有限公司）；微波消解仪（TOPEX+，上海屹尧仪器科技发展有限公司）；黄曲霉毒素免疫亲和柱（AF1351-1812，Romer）；真空固相萃取装置（Mediwax 12孔，北京科百特科技有限公司）。

1.2 试剂乙腈（默克，批号：JA073430）；甲醇（默克，批号：I0964207832）；无水硫酸镁（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10418599）；乙二核基-N丙基（PSA，天津博纳艾杰尔科技有限公司，批号：P19-00436）；甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20170110）；乙酸铵（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20171007）；纯化水（一级水）；吡虫琳（农业部环境保护科研检测所，批号：201904，纯度为100%）；噁草酮（BePure，批号：B0004342，纯度为98.00%）；乙酸乙酯（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20181124）；冰醋酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20170510）；氯化钠（天津市大茂化学试剂厂，批号：20190504）；PSA粉末（优级，艾杰尔菲诺美，批号：P19-00436）；C18粉末（优级，艾杰尔菲诺美，批号：P19-00345）；硝酸（成都市科隆化学品有限公司，批号：2019052201）；过氧化氢（广州化学试剂厂，批号：20180901-1）；ICP分析用标准溶液26元素混合标准溶液（o2Si，批号：977657-4）；黄曲霉毒素G1、G2、B1、B2混合标准溶液（Pribolab，批号：1100A25）。

1.3 样品来源收集市场上牛膝不同等级与酒牛膝饮片共35批，均来源于河南道地产区，河南中医药大学张振凌教授鉴定为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根经炮制后的饮片，符合2015年版《中华人民共和国药典》牛膝饮片质量标准。样品信息见表1。

表1 牛膝样品信息

2 方法与结果

2.1 方法重金属含量测定参照《中华人民共和国药典》（2015年版）四部通则0412电感耦合等离子体质谱法，《中华人民共和国药典》（2015年版）四部通则2321铅、镉、砷、汞、铜测定法进行测定。吡虫啉残留量参照NY/T 1379-2007《蔬菜中334种农药多残留的测定液相色谱-质谱/质谱法》进行测定；噁草酮残留量参照GB 23200.113《食品安全国家标准·植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定气相色谱质谱联用法》进行测定。黄曲霉毒素残留量参照《中华人民共和国药典》（2015年版）四部通则0431质谱法、《中华人民共和国药典》（2015年版）四部通则2351黄曲霉毒素测定法进行测定[10]。

2.2 结果牛膝与酒牛膝样品中重金属镉、砷、铜含量分别为0.03～0.10、0.02～0.20、3.00～5.00 mg/kg，重金属铅、汞、农药残留及黄曲霉毒素未检出。根据《中华人民共和国药典》（2015年版）四部通则2341农药残留量测定法及中华人民共和国外经贸行业标准《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》对重金属、农药及黄曲霉毒素残留检出限及限量规定：铅≤5.0 mg/kg、镉≤0.30 mg/kg、砷≤2.0 mg/kg、汞≤0.20 mg/kg、铜≤20.00 mg/kg、黄曲霉毒素B1≤5.00 μg/kg，吡虫啉检出限为0.005 mg/kg，噁草酮检出限为0.05mg/kg，牛膝不同等级饮片与酒牛膝中重金属、农药及黄曲霉毒素含量均符合相关限量标准。测定结果见表2～3。

表2 牛膝不同等级饮片与酒牛膝重金属测定结果

表3 牛膝不同等级饮片与酒牛膝农药残留及黄曲霉毒素测定结果

3 结果分析

3.1 牛膝不同等级饮片重金属含量分析对20批牛膝不同等级饮片重金属含量进行分析，牛膝饮片重金属镉、砷、铜残留水平见表4。结果表明，不同等级重金属含量差异性较小，以牛膝不同等级饮片重金属镉、砷、铜平均值比较，镉、砷含量由低到高为：一等＜二等≤统货＜三等，铜含量由低到高为：统货/三等＜二等＜一等。（见图1）

表4 牛膝不同等级重金属残留水平

图1 牛膝不同等级饮片重金属平均含量

3.2 牛膝、酒牛膝重金属含量分析根据结果，使用SIMCA 14.1软件对牛膝和酒牛膝中重金属镉、砷、铜含量进行PCA分析，用UV算法进行特征缩放，调整主成分个数为3，使Q2大于0.5，得出三维散点图（见图2）。根据散点图可将样品分为两类，即牛膝、酒牛膝，分类结果与样品规格信息基本一致，以不同炮制品牛膝与酒牛膝重金属镉、砷、铜含量平均值比较，可知牛膝中镉、砷、铜含量均低于酒牛膝。（见表5）

图2 牛膝、酒牛膝PCA散点图

表5 牛膝饮片与酒牛膝重金属平均含量

4 讨 论

不同等级牛膝饮片中多种化学成分含量有差异，但其有害残留物是否也因等级不同有差别尚未可知。本研究对牛膝不同等级不同炮制品中的重金属、农药残留、黄曲霉毒素进行测定，比较牛膝不同等级不同炮制品间含量差异，探讨牛膝不同炮制方法及不同商品等级饮片中有害残留物的分布规律。

重金属是指相对密度在4.5 g/cm3以上的金属，在人体中累积达到一定程度，会造成慢性中毒，严重影响人们的身体健康。重金属在水中不能被分解，人饮用后毒性放大，与水中的其他毒素结合生成毒性更大的有机物或无机物，影响人体健康。生长发育期儿童体内含有过多的铅可导致智力水平降低、学习记忆功能损害、精细技巧障碍等一系列神经系统的损害[11]；镉位列“五毒”（铜、汞、砷、镉、铅）之首,是一种强致癌物质[12]，具有肾毒性，肝毒性[13]，内分泌和生殖毒性等[14]。砷暴露造成大鼠海马神经元细胞损伤[15]；汞具有神经毒性[16]，可通过线粒体凋亡途径诱导星形胶质细胞凋亡；铜是人体必需的微量元素，是人体中多种酶的组成部分，参与人体的造血过程及铁的代谢，影响中枢神经系统、生殖机能、防御机能、精神智力活动和激素代谢等，铜参与黑色素的形成，缺铜可致毛发脱色甚至成为白化病[17]。本研究所用牛膝均为合格饮片，服用不会对人体产生不良影响，一等饮片中镉、砷等有害元素含量最低，铜含量最高，质量相对较好，临床上可使用优等饮片，既能发挥药效又能适量补充铜元素增强人体防御机能。

本次测定牛膝饮片与酒牛膝均符合相关标准要求，对镉、砷和铜进行分析，牛膝不同等级饮片中镉、砷含量由低到高为：一等＜二等≤统货＜三等，铜含量由低到高为：统货/三等＜二等＜一等；牛膝中镉、砷、铜含量均低于酒牛膝。牛膝不同等级饮片及不同炮制品中重金属含量差异较小，重金属镉、砷主要分布于低等级饮片中，其原因可能因为低等级饮片多来源于直径较细的牛膝药材，表皮与土壤等环境接触面积较大，吸收重金属的机会较多。另外，本研究所用牛膝均为道地药材，李金亭等[18]研究表明道地牛膝对铜的富集能力较强，这可能与牛膝中化学成分对重金属结合能力不同导致的，铜含量越高结合能力越强，而对镉、砷的结合能力则相反，牛膝对铜的结合吸收作用较镉、砷强，也可能与土壤中的重金属有关，牛膝种植过程中可通过调节土壤环境控制牛膝质量。通过不同炮制品之间的对比，炮制过程可能导致重金属含量出现差异，在黄酒生产过程中原料、设备等均可能引入重金属，黄酒中含有镉、砷、铜等金属元素，可能导致酒牛膝中重金属含量增加，另外，酒牛膝炮制过程中需加热炒制，水分流失，也可导致重金属含量相对增加。

牛膝是多年生草本药用植物，在种植过程中杂草较多且易感染多种病虫害，需用农药进行喷洒除去杂草和害虫。吡虫啉是烟碱类超高效杀虫剂，噁草酮为我国东北地区水、旱田作物主打除草剂品种[19]。黄曲霉毒素对人及动物肝脏组织有破坏作用，可导致肝癌甚至死亡[20]。牛膝在种植、运输、生产、加工、储存等的过程中由于操作不当可能会出现发霉变质的现象，产生生物毒素。本研究所用牛膝饮片来源于道地产区，进行规范化种植、采收、加工等，结果未检测出农药及黄曲霉毒素残留量，说明饮片质量较好。

牛膝不同等级饮片、不同炮制品中有害残留物含量存在差异，2015年版《中华人民共和国药典》未对牛膝等级进行划分，不同炮制方法不同商品等级饮片有害残留物含量未做限量规定，本研究可为牛膝饮片质量分级和质量评价提供参考依据。