UPLC法同时测定红景天及其市场流通品4种成分的含量*

徐智玮，李亚伟，吴立斌，李永鹏，贾守宁，宋 霞，刘亚蓉，陈文娟，窦 萱

（1.青海省中医院，青海 西宁 810000；2.青海药品检验检测院，青海 西宁 810016）

红景天作为雪域高原圣药，以其独特的生长环境和显著的药效而著称。红景天始载于《四部医典》[1]，藏药经典著作《晶珠本草》对其功效进行了详细的描述，言“红景天活血清肺、止咳退烧、止痛，用于治疗肺炎、气管炎、身体虚弱、全身乏力、胸闷、难于透气、嘴唇和手心发紫”[2]。《中华人民共和国药典》2020年版中规定红景天正品基源为大花红景天Rhodiola crenulata（HK.f.et Thoms.）H.Ohba的干燥根和根茎，具有益气活血、通脉平喘功效，用于气虚血瘀、胸痹心痛、中风偏瘫、倦怠气喘[3]。随着红景天药用价值的不断挖掘，目前连花清瘟胶囊为主的中成药制剂，不仅在国内防治新型冠状病毒肺炎上发挥作用，更是加快了踏上国际舞台的脚步[4]。红景天作为组方中的重要一味药，现面临着红景天药材基原混乱[5-6]和正品大花红景天原生环境遭到破坏[7-8]等诸多制约红景天产业发展的问题。基于全国第四次中药资源普查成果，实验考察了正品大花红景天、市场流通品小花红景天、地标品狭叶红景天及习用品唐古红景天，通过超高效液相色谱（UPLC）法测定红景天主要成分红景天苷及其苷元酪醇、没食子酸和咖啡酸的含量后进行分析，为红景天药材的质量评价、生产加工及扩大药源提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器美国WATERS（Acquity-uplc）超高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器（PDA）；ACE Excei 2 C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2 um）；AE200电子天平（梅特勒）；XS105DU分析天平（梅特勒）；超声清洗器（科桥）。

1.2 试剂乙腈（色谱纯，Merck公司）；50%甲醇（自配）；磷酸（分析纯）；超纯水（Millipore公司）。没食子酸（批号：110831-201805，纯度＞98%）、红景天苷（批号：110818-201804，纯度＞98%）、咖啡酸（批号：110831-201805，纯度＞99.7%）均购自中国食品药品检定研究院；酪醇（批号：110818-201804，纯度＞98%）购于上海源叶生物科技有限公司。

1.3 药材收集的19批红景天药材部分采于资源普查中，全部经青海省中医院中药基础研究所赵国福主任鉴定为正品：大花红景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H.Ohba，习用品狭叶红景天R.kirilowii（Regel）Maxim.，习用品唐古红景天R.tangutica（Maximowicz）S.H.Fu，代用品市售品小花红景天基原名为长鞭红景天R.fastigiata（Hook.f.et Thoms.）S.H.Fu。（见表1）

表1 19批不同来源红景天药材信息表

续表1：

2 实验方法

2.1 色谱条件色谱柱为ACE Excei 2 C18柱（100 mm×2.1 mm，2 μm）；流速为0.4 mL/min，柱温为30℃，进样体积为5 μL，检测波长为275 nm；流动相A为0.1%的磷酸超纯水溶液,流动相B为乙腈溶液，分析时间为15 min。梯度洗脱程序如下：0～1 min（96%A），1～3 min（90%A），3～15 min（96%A）。

2.2 供试品溶液制备精密称取不同品种、不同批次的红景天粉末1 g，置100 mL锥形瓶中，加50%甲醇100 mL，20℃超声处理（功率250 W，频率40 kHz）1 h，静置室温，滤过，滤液先过微孔滤膜（0.45 μm），然后过微孔滤膜（0.25 μm），取续滤液作为供试品溶液。

2.3 对照品溶液制备分别精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品3.55 mg、红景天苷对照品2.05 mg、酪醇对照品4.21 mg和咖啡酸1.25 mg分别置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为对照品储备溶液，用时各精密量取1 mL混合即得对照品溶液。在该色谱条件下，各成分峰之间分离度均大于1.5，理论塔板数以没食子酸峰计应不低于4 000，色谱图见图1。

图1 混合对照品及供试品UPLC图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.3”项下混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分的进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果表明4个化合物在其线性范围内线性关系良好。取“2.3”项下混合对照品溶液用甲醇逐级稀释后进样测定，按（S/N=10）、（S/N=3）分别计算定量限（LOQ）和检出限（LOD），结果见表2。

表2 各成分回归方程与线性关系

2.4.2 精密度试验 精密吸取“2.2”项下供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸峰面积的RSD分别为0.40%、0.59%、0.75%、0.34%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一批大花红景天样品（大花S1），按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样同一供试品溶液，分别计算4种化合物峰面积的RSD值。结果显示没食子酸RSD为0.42%、红景天苷RSD为0.60%、酪醇RSD为0.78%、咖啡酸RSD为0.34%，可见样品在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批供试品S1，按照“2.2”项下方法平行提取6份，在优化的色谱分析条件下连续进样，计算4种化合物峰面积的RSD值。结果没食子酸RSD为2.1%、红景天苷RSD为4.2%、酪醇RSD为3.01%、咖啡酸RSD为2.35%，RSD值均小于5%，表明其重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取同一批大花红景天供试品（大花S1），按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，平行取样6次，分别加入各单一对照品储备溶液适量，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液并测定，并按照公式计算各个化学成分的平均回收率。（见表3）

表3 红景天中4种化学成分的加样回收率试验结果（n=6）

2.4.6 红景天中4种化学成分的含量测定 精密称定19批不同批次红景天药材粉末，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样分析，图2为供试品溶液与混合对照品溶液的高效液相色谱图（波长为275 nm）。根据上述标准曲线及线性范围所得的回归方程计算不同批次供试品溶液中4种化学成分的含量，结果见表4。

表4 不同批次红景天中4种化学成分的含量测定结果（mg/g，n=3）

图2 不同批次红景天中4种化学成分的分析结果（n=3)

3 结果及分析

3.1 制备条件与优化

3.1.1 提取红景天溶剂筛选 本实验考察了蒸馏水、乙醇、甲醇作为溶剂提取红景天中的化合物，红景天含有大量的多糖物质，用溶剂水和乙醇提取，提取液比较黏稠，不宜过分子膜，且进样后各个峰之间分离度差，杂峰较多。故最终选择甲醇作为红景天药材提取溶液。在此基础上，对同一条件下30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇进行考察，结果发现用50%甲醇提取出峰较多，且峰形较好。最终确定以50%甲醇为溶剂制备红景天药材供试品溶液。

3.1.2 制备方法与优化 本实验考察了超声提取法和加热回流法的提取工艺，发现加热回流法提取费时费力，提取的有效成分含量比超声提取法低。同时发现在室温25℃，超声1 h效果好。

3.1.3 色谱条件的筛选与优化 本实验考察了不同的流动相系统如甲醇-水、乙腈-水对提取工艺的影响，发现乙腈-水系统梯度调整效果好。同时本实验红景天的主要有效成分红景天苷和主要成分没食子酸均为酚类化合物，显酸性，故在流动相中加入一定量的酸以抑制酚羟基离子化，结果表明分离效果明显提高。在酸的种类的选择上，比较了甲酸、磷酸和冰醋酸溶液，分离效果甲酸＞磷酸＞冰醋酸；但是甲酸作为有机酸，酸性明显强于磷酸，使用时间长容易腐蚀色谱柱，故选择流动相乙腈-磷酸水。同时也考察了在超纯水中加入（0.05%、0.10%、0.20%）的磷酸、柱温（30、35、40℃）及流速（0.3、0.4、0.5 mL/min）。最终结果表明，流动相为0.10%的磷酸水-乙腈溶液、流速为0.4 mL/min，柱温为30℃时对红景天药材经行梯度洗脱，基线平稳、各化合物之间分离度高且峰形较好。

3.2 含量测定结果相关性分析

3.2.1 红景天苷与酪醇之间存在相互转化 笔者测定14批红景天药材中，供试品S3、S6、S9、S14、S15至少存放了两年以上，供试品S1、S4、S10、S11至少存放了一年以上，而S2、S5、S7、S8、S12均为当年采收。结合表4数据可以得知红景天苷的含量随着时间的增长而递减，且供试品S3与S6相比其他中酪醇含量较高。由此可以得出红景天苷及其苷元酪醇之间存在相互转化，红景天苷随长时间的存放水解转化为酪醇。（见图3）

图3 储存时间影响红景天有效成分含量

3.2.2 红景天根茎生长年限影响红景天苷的含量 笔者测定15批红景天药材中，供试品S13的红景天苷含量在检测线之下，在采挖供试品S13中发现其根部已腐朽严重；发现5年生的红景天药材中红景天苷含量均高于同品系下的红景天。分析原因可能在于野外生长的红景天，其药用根茎生长年限一般5年左右适合采收，而超过5年以上的生长期的根茎往往容易腐朽，其药用成分红景天苷的含量会降低。以后规模化种植红景天采收季节可选在5年左右。（见图4）

图4 生长年限影响红景天有效成分含量

3.2.3 红景天采收部位影响红景天苷的含量 本文测定5批唐古红景天药材中，只有供试品S9、S10与S11红景天苷含量低于2015版《中华人民共和国药典》规定的0.5%，分析原因在于S9、S10、S11采挖于山坡石缝中，一般以采集地上根茎较多；而S7采挖于溪边，较容易采集到它的根。原因分析可能在于红景天根的红景天苷含量会高于根茎。

3.2.4 小花红景天中红景天苷含量基本在检测线以下 本实验测定4批小花红景天药材中，发现小花红景天显效物质红景天苷含量基本在检测线之下，而没食子酸含量高于其他几种红景天。

4 小 结

本实验考察不同的流动相系统进行梯度洗脱，如甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水等溶剂系统。结果以流动相为0.1%的磷酸水-乙腈溶液、流速为0.4 mL/min，柱温为30℃时对红景天药材经行梯度洗脱，基线平稳、各化合物之间分离度高。最终通过对PDA检测器下的图谱进行观察，275 nm处红景天没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸均显示出较强的响应值，且4个色谱峰峰型好，最终选择275 nm为检测波长。整个方法简单，便于操作和控制成本。而且实验使用UPLC法能大大缩短了检测时间，该方法10 min内就完成红景天4种化合物的检测工作，比传统高效液相色谱（HPLC）检测时间缩短了0.5～1.0 h，符合现代化中药检测要求。

近些年来大花红景天5 000 m以上的自然环境不断遭受破坏，当地政府也相继出台了保护政策，使大花红景天的价格不断攀升而市场却依然供不应求。目前甘肃、四川省已将狭叶红景天这一药用品种纳入地方现行药材标准中，目前是唯一栽培成功的品种，栽培种植年限可考虑在5年左右。而唐古红景天用药历史已有千年，本实验中4种成分含量与大花红景天近似，红景天苷含量也仅次于大花红景天，可建议作为大花红景天的新药源；而长鞭红景天根茎以其形似大花红景天，且具有相当丰富的蕴藏量，被称为小花红景天。现作为大花红景天的代用品大量流入市场、药店和药厂，但是实验结果显示其主要成分红景天苷基本在检测线下，应继续深入研究。