重楼皂苷Ⅰ对胃癌SGC-7901细胞线粒体自噬的作用及对LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Caspase-3表达的影响

张秉丽，霍成英，李有连

（青海仁济医院，青海 西宁 810000）

胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，在我国的发病率与病死率仅次于肺癌与肝癌，居第3位，其发病率和病死率仍在逐年上升[1]。而且，胃癌早期临床症状不明显，确诊时多为胃癌中晚期，化疗、放疗及手术治疗疗效不明显，严重威胁人类生命健康[2]。胃癌患者临床治疗失败和死亡的主要原因是肿瘤侵袭转移和复发。自噬是存在于真核细胞内利用溶酶体降解自身受损细胞器和大分子物质的过程，是细胞应对恶劣环境的生存机制，与肿瘤的发生、增殖、侵袭转移等密切相关。重楼皂苷Ⅰ是从中药重楼中提取的一种小分子单体，属于甾体皂苷，毒副作用小、抗肿瘤效应强，能影响多种肿瘤细胞和移植瘤的生长[3-4]。研究表明，重楼皂苷Ⅰ通过调节细胞自噬能够抑制胃癌细胞侵袭能力[5]。微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）是线粒体自噬标记蛋白，参与自噬膜的形成，是自噬形成的标志性因子，研究发现，LC3与肿瘤的发生发展密切相关[5]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartatespecific proteinases 3，Caspases-3）是细胞凋亡效应因子，高表达可诱导细胞凋亡[6]。重楼皂苷Ⅰ抑制肿瘤的作用早有报道，但其发挥作用的机制尚不清楚，是否通过调控自噬与凋亡发挥作用有待证实。本研究主要探讨重楼皂苷Ⅰ对胃癌SGC-7901细胞线粒体自噬的作用及对线粒体自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和凋亡蛋白Caspase-3表达的影响。

1 材 料

1.1 细胞系人胃癌SGC-7901细胞，购买于美国ATCC公司。

1.2 试剂重楼皂苷Ⅰ（成都普瑞法科技开发有限公司，纯度：95%～99%，规格：100 mg，批号：180223）；胎牛血清（批号：150712）、1640-RPMI培养基（批号：161124）、噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）试剂（批号：180414）均购自美国Gibco公司；Annexin V-异硫氰酸荧光素（flourescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：170927）；二甲基亚砜（美国Sigma公司，批号：161117）；兔抗人Beclin-1单克隆抗体（批号：081105）、兔抗人LC3-Ⅰ单克隆抗体（批号：201412）、兔抗人LC3-Ⅱ单克隆抗体（批号：150413）、兔抗人Bcl-2单克隆抗体（批号：101019）、兔抗人Bax单克隆抗体（批号：180522）、兔抗人Caspase-3单克隆抗体（批号：170915）、辣根过氧化酶标记的山羊抗兔多抗（批号：190308）均购自英国abcam公司。

1.3 主要仪器TE2000-U型倒置生物显微镜（日本Nikon公司）；FACSCalibu型流式细胞仪系统（美国BD公司）。

2 方 法

2.1 细胞培养将SGC-7901胃癌细胞接种于含10%胎牛血清和1%双抗的1640-RPMI培养基中，置于含5%CO2恒温37℃的细胞培养箱中培养。2～3 d传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 分组及药物处理用含10%胎牛血清的1640-RPMI液体培养基溶解重楼皂苷Ⅰ，分成重楼皂苷Ⅰ低剂量组、重楼皂苷Ⅰ中剂量组、重楼皂苷Ⅰ高剂量组，分别以质量浓度为1.5、3.0、6.0 mg/mL重楼皂苷Ⅰ培养胃癌细胞。对照组用含10%胎牛血清的1640-RPMI培养基培养胃癌细胞。

2.3 细胞增殖抑制率检测取对数生长期SGC-7901细胞，PBS冲洗，胰酶消化5 min，细胞密度1×105个/mL，接种于96孔板。细胞贴壁后，对照组、重楼皂苷Ⅰ低剂量组、重楼皂苷Ⅰ中剂量组、重楼皂苷Ⅰ高剂量组更换为对应的培养基，200μL/孔，分别培养24、48、72h。在各时间段结束前4 h每孔加20μL 5mg/mL的MTT溶液，孵育4 h，每孔加150 μL DMSO，充分震荡10 min，用全自动酶标仪检测490 nm处各孔的吸光度（A）值，每组每个时间点均设置5个复孔，计算增殖抑制率。增殖抑制率=（对照孔A值-药物孔A值）/对照孔A值×100%。

2.4 透射电镜观察SGC-7901细胞超微结构的改变取各组培养72 h的SGC-7901胃癌细胞加入体积分数2.5%戊二醛和1%锇酸固定细胞，丙酮脱水，制片，铅、铀各复染10 min，透射电子显微镜下对细胞自噬小体进行观察，拍照。

2.5 Lyso-Tracker Red染色观察SGC-7901细胞自噬情况取各组培养72 h的SGC-7901胃癌细胞，PBS清洗后，暗室中加入50 nmol/L的Lyso-Tracker Red染液，孵育30 min，清洗。加入Hoechst 33342染液再次孵育20 min，清洗后制片，6 h内置于荧光显微镜下观察并拍照，镜下红色荧光小体为溶酶体。

2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡情况取各组培养72 h的SGC-7901胃癌细胞，胰酶消化，收集细胞，室温2 000 r/min离心5 min，离心半径8 cm，弃上清，用提前预冷的PBS漂洗后，加入195 μL Binding buffer重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC，4℃避光孵育15 min，加入10 μL PI染色5 min，置于流式细胞仪检测细胞凋亡情况。每组均设5个复孔。

2.7 Western blotting法检测胃癌细胞Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相对表达量取各组培养72 h的SGC-7901胃癌细胞，收集细胞，提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，每孔加入蛋白样品40 μL，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，5%脱脂奶粉孵育1 h，加1∶1 000稀释的Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗，4℃摇床孵育过夜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入1∶4 000相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，摇床室温孵育2 h。TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加ECL超敏发光液，凝胶成像系统显影，以目的蛋白和β-actin蛋白条带灰度比值作为目的蛋白相对表达量。

2.8 统计学方法采用SPSS 24.0统计学软件分析数据，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 重楼皂苷Ⅰ对细胞增殖的影响24、48、72 h细胞增殖抑制率各组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，重楼皂苷Ⅰ低、中、高剂量组24、48、72 h细胞增殖抑制率均升高（P＜0.05）；与重楼皂苷Ⅰ低剂量组比较，重楼皂苷Ⅰ中、高剂量组24、48、72 h细胞增殖抑制率均升高（P＜0.05），且重楼皂苷Ⅰ高剂量组各时间细胞增殖抑制率高于重楼皂苷Ⅰ中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。重楼皂苷Ⅰ低、中、高剂量组细胞增殖抑制率均随时间延长而增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。（见图1）

图1 重楼皂苷Ⅰ对细胞增殖的影响（±s，n=5）

3.2 透射电镜观察SGC-7901细胞超微结构的改变对照组SGC-7901细胞结构完整，线粒体形态、核仁等正常，仅可见少量自噬小体形成；重楼皂苷Ⅰ低、中、高剂量组SGC-7901胃癌细胞椭圆形的双层膜包绕囊泡状结构增多，内含有各种蛋白及线粒体，自噬小体数量逐渐增多。（见图2）

图2 各组SGC-7901细胞超微结构比较

3.3 Lyso-Tracker Red染色观察SGC-7901细胞自噬情况Lyso-Tracker Red染色结果显示，重楼皂苷Ⅰ低、中、高剂量组SGC-7901胃癌细胞溶酶体红色荧光小体增加，出现酸性自噬溶酶体囊泡过度累积的现象。（见图3）

图3 各组SGC-7901细胞自噬情况比较

3.4 细胞凋亡率比较细胞凋亡率组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，重楼皂苷Ⅰ低、中、高剂量组细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与重楼皂苷Ⅰ低剂量组比较，重楼皂苷Ⅰ中、高剂量组细胞凋亡率升高（P＜0.05），且重楼皂苷Ⅰ高剂量组细胞凋亡率高于重楼皂苷Ⅰ中剂量组（P＜0.05）。（见表1、图4）

图4 各组胃癌SGC-7901细胞凋亡情况

表1 各组细胞凋亡率比较（±s，n=5）

表1 各组细胞凋亡率比较（±s，n=5）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与重楼皂苷Ⅰ低剂量组比较，bP＜0.05；与重楼皂苷Ⅰ中剂量组比较，cP＜0.05

组别 凋亡率对照组 2.21±1.32重楼皂苷Ⅰ低剂量组 12.72±1.39a重楼皂苷Ⅰ中剂量组 26.25±2.73a b重楼皂苷Ⅰ高剂量组 38.87±3.22a b c F 36.772 P 0.000

3.5 各组胃癌细胞Beclin-1、Caspase-3蛋白相对表达量及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Bcl-2/Bax比值比较Beclin-1、Caspase-3蛋白相对表达量及Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，重楼皂苷Ⅰ低、中、高剂量组Beclin-1、Caspase-3蛋白相对表达量升高，Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低（P＜0.05）。与重楼皂苷Ⅰ低剂量组比较，重楼皂苷Ⅰ中、高剂量组Beclin-1、Caspase-3蛋白相对表达量升高，Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低（P＜0.05）；与重楼皂苷Ⅰ中剂量组比较，重楼皂苷Ⅰ高剂量组Beclin-1、Caspase-3蛋白相对表达量升高，Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低（P＜0.05）。（见表2、图5）

表2 各组胃癌细胞Beclin-1、Caspase-3蛋白相对表达量及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Bcl-2/Bax比值比较（±s，n=5）

表2 各组胃癌细胞Beclin-1、Caspase-3蛋白相对表达量及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Bcl-2/Bax比值比较（±s，n=5）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与重楼皂苷Ⅰ低剂量组比较，bP＜0.05；与重楼皂苷Ⅰ中剂量组比较，cP＜0.05

组别 Beclin-1 Caspase-3 LC3-Ⅰ/LC3-ⅡBcl-2/Bax对照组 0.39±0.06 0.41±0.05 1.13±0.12 1.27±0.13重楼皂苷Ⅰ低剂量组0.52±0.07a 0.65±0.07a 0.83±0.09a 0.96±0.10a重楼皂苷Ⅰ中剂量组0.88±0.09ab 0.91±0.10ab 0.63±0.07ab 0.82±0.09ab重楼皂苷Ⅰ高剂量组1.14±0.11abc 1.16±0.13abc 0.38±0.04abc 0.53±0.06abc F 36.773 42.383 28.427 39.036 P 0.000 0.000 0.000 0.000

图5 各组胃癌细胞Beclin-1、Caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bcl-2、Bax蛋白表达Western blotting图

4 讨 论

胃癌是源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，由多种因素引起，慢性胃炎等胃部疾病，或幽门螺杆菌感染，以及不良饮食习惯、环境和遗传等多种因素的共同作用，导致胃癌的发生[7]。近年研究发现，多种中药活性成分具有抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡的作用，临床上使用中药治疗恶性肿瘤疗效显著，可改善化疗后毒性反应，使用安全且不良反应较小，具有广阔的应用前景[8]。临床研究证实，重楼皂苷Ⅰ可诱导肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌及子宫癌等多种恶性肿瘤细胞凋亡，具有显著的抗癌作用，探讨重楼皂苷Ⅰ抗癌机制，对于提高肿瘤患者生存率意义重大[9-10]。

重楼皂苷Ⅰ主要提取自百合科植物云南重楼或七叶一枝花干燥根茎，药理学活性较广泛，包括抗肿瘤、免疫调节、保护心血管等，且能抑制肿瘤细胞增殖。线粒体自噬是细胞清除体内损伤线粒体及维持自身稳态的一种重要调节机制，为细胞应对恶劣环境的生存机制，在肿瘤发生、增殖、侵袭、转移等过程中发挥重要作用，且受多种调控因子影响[5]。近年来，重楼皂苷Ⅰ的临床研究不断深入，发现重楼皂苷Ⅰ可诱导多种肿瘤细胞自噬，以发挥抗肿瘤作用。WANG W P等[11]研究表明重楼皂苷Ⅰ不仅能诱导人肝癌细胞出现Caspase依赖的线粒体途径凋亡，还能诱导肿瘤细胞线粒体自噬，影响细胞内自噬标志蛋白表达水平。陈舒怡等[12]发现重楼皂苷Ⅰ可通过线粒体碎裂，诱导人肺癌NCI-H661细胞凋亡。这些研究均提示重楼皂苷Ⅰ可能在肿瘤细胞线粒体自噬中发挥重要作用，但目前临床就重楼皂苷Ⅰ对胃癌SGC-7901细胞线粒体自噬作用仍无明确定论。本研究结果显示，重楼皂苷Ⅰ各剂量组给药后细胞增殖抑制率、凋亡率均显著升高，自噬小体及自噬溶酶体数量增多，这提示重楼皂苷Ⅰ可抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，促进线粒体自噬，进而促进细胞凋亡。

LC3是哺乳动物细胞中酵母ATG8基因的同源物，包括Ⅰ型与Ⅱ型。发生自噬时，LC3-I脂质化形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ与自噬体膜上的磷脂酰乙醇胺结合并定位在胞内自噬体膜上。LC3-Ⅱ含量与自噬体数量呈正比，是自噬起始阶段的分子标记物。研究发现类风湿关节炎患者机体处于氧化应激状态，低浓度H2O2能促进类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖，白藜芦醇可抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和促进凋亡，其机制可能与降低自噬蛋白LC3-I/II、Beclin-1表达有关[13]。Caspases家族是细胞凋亡过程中的关键元件，其激活与过表达会引起细胞凋亡，并通过与众多蛋白因子相互作用调控细胞凋亡[14]。Caspase-3处于凋亡有序级联反应的下游，是细胞凋亡的关键执行者与主要效应因子，是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点，它的活化是凋亡进入不可逆阶段标志[15]。刘文粤等[16]发现藤黄酸能够诱导Caspase-3活性促进食管鳞状细胞癌TE-1细胞凋亡。研究发现胞浆转导肽介导抑癌基因导入肾癌786-O细胞中，并对肾癌786-O细胞有明显的抑制作用，可能是通过影响Bax-Caspase-3凋亡通路的活性，抑制786-O细胞的增殖，诱导凋亡发挥抑癌作用[17]。本研究中重楼皂苷Ⅰ低、中、高剂量组与对照组比较，Beclin-1、Caspase-3蛋白相对表达量升高，Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低，且效果呈剂量依赖性，提示重楼皂苷-Ⅰ能促进人胃癌SGC-7901细胞线粒体自噬，可通过上调Beclin-1、Caspase-3的表达，降低Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值，诱导自噬，促进凋亡，发挥抗癌作用。

综上所述，重楼皂苷Ⅰ促进胃癌SGC-7901细胞线粒体自噬，可能是通过调控凋亡及自噬相关基因，上调Caspase-3，降低LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ发挥作用。