基于“肾络癥瘕”理论探讨肾炎防衰液治疗肾间质纤维化的药效物质基础与机制*

刘梦超，王明哲，肖 遥，沈 存，王梦迪，赵文景

（1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.北京中医药大学，北京 100010）

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是大多数慢性肾脏疾病的共同途径，以成纤维细胞增生、细胞外基质在肾间质过度沉积为主要病理特征，在肾脏结构和功能的逐步丧失中起重要作用。无论是肾小球疾病、肾小管间质病变还是肾血管疾病，其肾功能损害的程度都与RIF密切相关[1-2]。肾间质纤维化程度也被认为是预后指标和治疗指导之一，然而目前在RIF的防治方面尚缺乏有效的措施。

中医药治疗RIF具有一定优势。“肾络癥瘕”理论[3-4]是王耀献以络病学说、癥瘕理论、肾脏病理研究为基础，由吕仁和糖尿病肾病“肾络微型癥瘕”理论发展推进而成，已形成理、法、方、药较完备的中医药治疗慢性肾脏疾病的理论体系。该理论认为慢性肾脏疾病的主要病机是肾疾日久，失治误治，“肾络徵瘕”形成，终致肾用失司，湿浊瘀毒潴留。聚散消长是“肾络癥瘕”理论的核心病机，持续的聚散失衡，肾络痰湿、瘀血、瘀毒渐聚胶结，即成“肾络癥瘕”，与RIF的病理发展过程相符合。

王耀献教授提倡应用消癥散结法，常用肾炎防衰液治疗RIF[5]。肾炎防衰液由黄芪、当归、海藻、熟地黄、大黄组成，有补气扶正、消癥散结之功，经多年临床证实其疗效确切。前期临床试验提示肾炎防衰液可延缓CKD5期非透析患者的首次进入透析时间，减少CKD5期患者透析事件发生率[6]；多项针对单侧输尿管结扎（unilateral ureteral obstruction,UUO）诱导的RIF大鼠模型的实验研究显示，肾炎防衰液对RIF具有抑制炎症、减少细胞外基质（extracellular matrix,ECM）积聚等作用[7-8]，但其具体机制尚未完全探明。因此，本研究通过可体现中医药多成分、多靶点、多途径的网络药理学方法，探寻肾炎防衰液治疗RIF的具体机制，以期为进一步的研究提供思路和依据。

1 材料与方法

1.1 肾炎防衰液有效成分及作用靶点的筛选 以“黄芪”“当归”“海藻”“熟地黄”“大黄”为检索词，通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索肾炎防衰液的化学成分，根据口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18进行筛选，获取肾炎防衰液的活性成分，并在该数据库查询这些成分的对应靶点。另以“HUANG QI”“DANG GUI”“HAI ZAO”“DI HUANG”“SHU DI HUANG”“DA HUANG”为关键词，于BATMAN-TCM数据库（http://bionet.Ncpsb.org/batman-tcm/)以“P＜0.05且Score cutoff≥39”为标准筛选肾炎防衰液的有效成分及作用靶点。利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）对靶点信息进行规范化处理。将上述筛选后的成分与靶点合并后去除重复项，建立“中药-成分-靶点”数据库。

1.2 RIF作用靶点的获取 以“renal interstitial fibrosis”为关键词，应用GeneCards数据库（https://genecards.weizmann.ac.il/v3/）、DisGeNET平台（https://www.disgenet.org/home/）获取RIF相关靶点，利用UniProt数据库进行规范化处理，合并后去掉重复项，获得RIF作用靶点。

1.3 网络构建

1.3.1 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络的构建 将“1.1”项中获取的成分靶点与“1.2”项中的RIF作用靶点通过韦恩图（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，获得共有靶点，即肾炎防衰液治疗RIF的潜在作用靶点。将其导入String数据库，限定物种为“Homo Sapiens”，构建PPI网络，然后将该文件导入到Cytoscape3.7.2软件进行分析，获得核心靶点。

1.3.2 “成分-靶点”网络的构建 将共有靶点与其对应中药成分通过Cytoscape3.7.2软件构建“成分-靶点”网络，利用“Network analyze”功能进行分析，并通过该软件的Centiscape插件根据自由度筛选出网络中的核心成分。

1.3.3 “中药-成分-靶点-疾病”网络的构建 基于“1.3.2”项的“成分-靶点”网络，与RIF、疾病靶点、中药关联，应用Cytoscape3.7.2软件绘制“中药-成分-靶点-疾病”网络并进行分析。

1.4 京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析 通过Cytoscape3.7.2的Clue GO 2.5.4插件对共有靶点进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，获取肾炎防衰液治疗RIF的主要通路。

1.5 分子对接预测 通过Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载核心成分的mol2格式，通过Chem3D对所下载的化合物进行能量最小化，并转化为pdb格式；通过PDB数据库（https://www.rcsb.org）下载自由度前5位核心靶点的晶体结构PDB格式文件。采用AutoDock Tools-1.5.6软件对上述文件进行常规处理，将处理后的化合物作为小分子配体，5种蛋白靶点作为受体，根据小分子与靶点的作用位点确定的Grid Box的中心位置以及长宽高，最后通过AutoDock vina和python脚本进行批量对接，对分子对接结果进行分析，化合物与蛋白的结合作用可视化采用Pymol软件。

2 结 果

2.1 药物成分筛选与潜在作用靶点的获取 通过TCMSP数据库与BATMAN-TCM数据库进行筛选，获得黄芪的活性成分38个，当归的活性成分124个，海藻的活性成分5个，熟地黄的活性成分5个，大黄的活性成分28个，总计200个。黄芪的潜在作用靶点253个，当归的潜在作用靶点468个，海藻的潜在作用靶点100个，熟地黄的潜在作用靶点94个，大黄的潜在作用靶点249个，总计1 164个。5种中药潜在作用靶点再次合并去重，获得肾炎防衰液潜在作用靶点共701个。将5种中药的潜在作用靶点绘制韦恩图，可见多种中药具有共同靶点。（见图1）

图1 中药潜在作用靶点分布

2.2 RIF靶点及共有靶点的获取 应用GeneCards数据库获取RIF靶点328个，通过DisGeNET平台获得138个，两者合并去重后获得RIF潜在靶点共429个，与肾炎防衰液的潜在作用靶点通过韦恩图取交集，获得76个共有靶点（见图2），这些靶点可能是肾炎防衰液治疗肾间质纤维化的潜在作用靶点。将这些靶点导入String数据库，限定物种为“Homo sapiens”，导出数据后应用Cytoscape3.7.2软件构建PPI网络，该网络共涉及76个节点和967条边，节点表示成分与靶点，边表示两者之间相互作用，自由度是重要的网络拓扑参数，表示与该节点直接相互作用的节点的数目，自由度越大，其关联的生物功能越多，在网络中的重要性就越大。结果显示，共有37个靶点自由度值高于平均值（25.78），表明与其他蛋白相互作用较强，可能具有重要作用。（见表1）

表1 自由度大于平均值的重要靶点

图2 RIF与肾炎防衰液的潜在作用靶点分布

2.3 成分-靶点网络的构建与分析 将“2.2”项中获取的76个共有靶点与其对应的117个中药成分通过Cytoscape3.7.2软件构建“成分-靶点”网络，筛选肾炎防衰液治疗RIF相关的活性成分。经网络拓扑学分析，“成分-靶点”网络共涉及194个节点，488条边，节点的最大自由度为75，大于平均自由度（5.03）的活性成分有24个。（见表2）。

表2 可能参与肾炎防衰液治疗RIF的活性成分

2.4 “药物-成分-靶点-疾病”网络的构建 将中药、包含共有靶点的成分、共有靶点与RIF通过Cytoscape3.7.2软件构建网络，红色六边形节点代表疾病，绿色菱形节点代表中药，蓝色矩形节点代表肾炎防衰液主要活性成分，黄色三角形节点代表潜在作用靶点。该网络共有200个节点，682条边，聚类系数0.357，网络密度0.032，最短路径为39 006（100%），网络异质性1.325，平均自由度为6.333。（见图3）

图3 肾炎防衰液治疗RIF“药物-成分-靶点-疾病”网络图

2.5 KEGG富集分析 将肾炎防衰液治疗RIF的共有靶点进行KEGG通路富集分析，筛选校正P≤0.01的项目，共富集到99条信号通路，根据P值由小到大排列，发现肾炎防衰液可能通过以下途径参与RIF的治疗，如糖尿病并发症的晚期糖基化终末产物（AGE）-晚期糖基化终末产物受体（RAGE）信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、松弛素信号通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、白介素-17（IL-17）信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、脂肪细胞脂肪分解的调节、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信号通路、Toll样受体（TLRs）信号通路等。（见表3）

表3 肾炎防衰液治疗RIF的潜在信号通路

2.6 分子对接 将24个核心成分作为小分子配体，选取自由度前5位的INS（PDB ID：6S4J）、IL-6（PDB ID：2HMH）、ALB（PDB ID：6RQ7）、VEGFA（PDB ID：4KZN）、TNF（PDB ID：2AZ5）作为蛋白受体进行分子对接，并获取其结合能。若结合能＜0，表明两者可自发结合，结合能≤-5.0 kJ/mol为分子与靶点结合性较好[9]，结合能越小表明结合活性越好。结果显示，表中77.5%的活性成分可与靶点蛋白较好地结合。（见表4）将上述各基因与其结合排名前2位的化合物的分子对接模式可视化，可见上述化合物可很好地匹配INS、IL-6、ALB、VEGFA、TNF的活性口袋。（见图4）

表4 肾炎防衰液核心成分与5种蛋白靶点的结合能（kJ/mol）

图4 活性成分与靶点蛋白的结合模式

3 讨 论

RIF的主要病理表现为间质成纤维细胞的增殖，ECM的过度沉积，细胞凋亡，肾小管损伤与大量炎症细胞浸润，其具体机制复杂，涉及多种炎症细胞和细胞因子信号传导之间复杂的相互作用，单一途径的药物很难奏效。因此，中医药的多成分、多靶点、多途径的特点具有一定优势。

肾炎防衰液是基于“肾络癥瘕”理论而成，气滞血行不畅、络脉失养、气血瘀滞、津凝痰结、络毒蕴结与现代医学中的血流动力学异常、细胞的保护及损伤、细胞因子的调节至ECM等有形之质的形成过程有一定相似之处[3-4]。在中医方面消癥散结，改善气血、痰浊、络毒等淤积，在现代医学方面改善大量炎症细胞浸润、抑制ECM的过度沉积等是本方的初衷。目前，前期临床及动物实验已证实其对RIF具有治疗作用，但具体机制尚未完全清楚，因此，本研究基于网络药理学探索其药效学基础及潜在作用机制以指导进一步的研究。

经数据库筛选，本研究共发现76个肾炎防衰液治疗RIF的潜在作用靶点，包括INS、IL-6、ALB、VEGFA、TNF、MAPK1、IL-1β、EGF、EGFR、TP53、MAPK8、NOS3、MMP9、CCL2、PTGS2、MAPK14、MMP2等。包含这些靶点的活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、7-O-甲基异丙醇胺、豆甾醇、3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、芦荟大黄素、芒柄花黄素、异鼠李亭、苯丁烯酮等。药理学研究表明，槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、异鼠李素、芦荟大黄素、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮均具有一定的抗炎、抗肿瘤作用。转化生长因子β（TGF-β）是迄今研究最多、最重要的致纤维化细胞因子，槲皮素可通过抑制TGF-β来延缓肾纤维化[10]。异鼠李素是源自槲皮素的代谢物，可调节NF-κB、PI3K/Akt、MAPK及其下游因子，阻断TLR4途径，减少ROS的产生以减轻炎症反应，还可抑制ROS介导的HIF-1α积累来发挥肾脏保护作用[11-12]。山萘酚可通过激活BMP-7-Smad1/5信号通路改善肾纤维化[13]。大黄酸是大黄中最具生物活性的成分，可通过调节AMPK/mTOR途径来抑制UUO大鼠肾小管细胞的自噬，抑制UUO诱导的p-STAT3、胶原蛋白I和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）[14-15]。此外，β-谷甾醇、豆甾醇还具有明显的降脂作用[16-17]，芒柄花黄素有抗氧化、降低高血糖、胰岛素抵抗等作用[18]。这些成分是肾炎防衰液发挥治疗作用的物质基础，提示肾炎防衰液可能通过抗炎、调节自噬、糖脂代谢等发挥治疗作用。

本研究进一步将76个肾炎防衰液治疗RIF的潜在作用靶点进行KEGG富集，发现肾炎防衰液可能通过抑制炎症反应，调节糖脂代谢、自噬、ECM的沉积等多个方面延缓RIF进程，与上文中活性成分的作用相符。

炎症反应在RIF的发生、发展中起着至关重要的作用。多种趋化因子、白细胞介素家族、黏附分子等可以刺激一系列炎症信号传导途径，导致ECM过度沉积，肾间质纤维化，最终导致肾功能不全。经KEGG富集的通路中，TNF信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、酪氨酸激酶/信号转导子和转录激活子（JAK/STAT）信号通路、Toll样受体信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路等均与炎性损伤密切相关。JAK/STAT信号通路是诱导巨噬细胞活化的重要通路。活化后的肾间质巨噬细胞可释放大量的炎症因子，进而促进成纤维细胞的激活，诱导肾小管上皮细胞的分化与凋亡。此外，巨噬细胞的浸润还可增加胶原的沉积，进一步加速RIF的进程。在本研究发现的潜在作用靶点中，多种细胞因子与JAK/STAT通路的激活相关，如IL-2与STAT1、STAT3、STAT5A和STAT5B的激活密切相关，IL-6可激活STAT1和STAT3，EGF可激活STAT3，IL-13可激活STAT6等。STAT1可与Runx调节蛋白的结合，作用于Smad3，STAT3与NF-κB的p50和p65亚基可直接结合，STAT1也与NF-κB存在协同作用[19-20]。可见JAK/STAT通路与本研究富集出的多个通路存在相互作用。TNF-α是TNF信号通路、MAPK信号通路和T细胞受体信号通路的关键因子，其作为最重要的炎症因子之一参与了RIF进程。激活的单核-巨噬细胞、损伤的肾小管上皮细胞、内皮细胞等均可产生该因子，其具有加速ECM堆积、损伤肾单位、促进系膜细胞增殖、加速脂质代谢等的作用，可进一步加重RIF。同时，TNF-α与NF-κB也存在协同作用，其升高可促进NF-κB水平的升高和NF-κB信号通路的激活，从而进一步增加炎症因子的表达，导致炎症损伤的加重。此外，Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）与丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）均参与介导肾纤维化中的促炎和促纤维化途径[21]。松弛素可在UUO的早期阶段下调TLR4-NF-κB信号通路，使巨噬细胞极化向M2表型转移，并改善RIF[22]。

自噬在RIF初期具有保护肾脏的作用，但自噬的持续激活可促进纤维化的产生[23]。PI3K/Akt信号通路具有调控自噬的作用，与RIF炎性损伤的发生有关，其主要被TGF-β1激活，且参与其诱导的肾小管上皮间质转分化过程[24]，还可通过mTOR信号通路的激活抑制细胞自噬[25]。

此外，MMPs/组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）的失衡直接影响ECM的沉积，在RIF的机制中具有重要的位置。本研究发现的潜在作用靶点中，MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、PLG，COL1A1是MMPs活化和胶原降解中的重要因子，可调控ECM的沉积，与肾炎防衰液拟通过消癥散结法改善肾纤维化的初衷相通。

综上所述，本研究筛选出肾炎防衰液多种可改善RIF的活性成分，发现其可能参与治疗RIF的多种途径，其中与炎症反应相关最多。全方可能通过抑制炎症反应、调控自噬、调节糖脂代谢等延缓RIF的发展。提示肾炎防衰液在抑制炎症反应方面的研究前景广阔，对自噬反应的调控也尚待进一步的研究。