基于网络药理学联合GEO芯片分析百合乌药汤治疗胃癌的分子靶点及作用机制*

任雪童，狄紫蕊，付冰倩，张 哲，杜艳茹

（1.河北中医学院研究生院，河北 石家庄 050091；2.河北中医学院第一附属医院，河北 石家庄 050011）

胃癌现今仍然是全世界的一种重要癌症，已成为第五位最常诊断的癌症和第三大癌症的死亡原因[1]。目前我国各年龄组的胃癌发病率已呈现出下降趋势，全人群的发病率增长趋势也有所缓解，但仍高于世界平均水平[2]。中医药治疗胃癌效果越发显著且副作用较小，采用中医药对胃癌防治成为一大研究热点，深入探索中医药治疗胃癌的分子机制，对于胃癌患者的精准治疗具有重要临床意义。

胃癌在中医属“胃脘痛”“噎膈”“反胃”“心腹痞”等范畴[3]。对胃癌的病机诸家学者认为其正气亏虚为根本，痰、瘀、毒、邪相互搏结为基本病机[4]。百合乌药汤首载于陈修园《时方妙用》[5]，现代临床中用于胃癌患者经放疗、化疗后出现的胃阴亏虚、虚火上炎等证颇有疗效[6]。现代研究发现百合甲醇提取物、百合总生物碱能阻滞SGC-7901细胞于G2/M期，诱导SGC-7901细胞凋亡是抑制SGC-7901细胞增殖的主要机制之一[7]。

目前对于中药复方治疗胃癌的药效基础和作用机制尚不明确，加之研究手段存在检测灵敏度低等局限性，难以全面阐述药物作用机制[8]。本研究通过网络药理学联合公共基因芯片数据库GEO，获取有关正常胃黏膜与胃癌标本的芯片，分析两者中存在的差异表达基因，力求为胃癌肿瘤标记物的进一步研究提供参考。并对百合乌药汤的主要活性成分进行筛选，分析活性成分的作用靶点及生物通路，从而阐明百合乌药汤治疗胃癌可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物成分的筛选 在TCMSP数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）中以“百合”“乌药”为关键词进行检索，按照口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18，限定物种为“Homo sapiens”为筛选条件，以得到活性成分[9]。

1.2 药物靶点的筛选 在TCMSP数据库中进行药物靶点的收集，将所得靶点导入UniPort（https://www.uniprot.org/）数据库中，校正所涉及的靶点信息和基因名称。

1.3 胃癌GEO芯片差异分析 在GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）检 索“gastric cancer”，筛 选 并 下 载GSE118916芯片和平台数据，使用R软件设定差异倍数（fold change，FC）绝对值＞1，矫正后P值（adjPvalue）＜0.05作为明显差异基因的筛选条件，得出差异分析结果并导入到Excel表格中。热图绘制：安装插件“packages”“pheatmap”及“Limma”包对芯片数据进行二次分析，并结合P值（adjPvalue）和FC的相关数值进行筛选，选取上调、下调最明显的前20个基因，并定义分组（C.正常对照组，T.肿瘤组）颜色、高度等绘制热图。火山图绘制：设置x轴与y轴最大值，先将基因统一设置为无差异基因，用“黑色”表示。再通过P、logFC进行筛选。当P＜0.05，logFC＞1，表示该基因上调，用“红色”表示。当P＜0.05，logFC＜1，表示该基因下调，用“绿色”表示。

1.4 治疗胃癌活性成分与作用靶点网络图的绘制“活性成分-靶点网络”主要通过网络图像化软件Cytoscape3.2.1进行构建和分析。本研究将从上述“1.2”获得的活性成分及靶点关系进行导入以完成相关网络构建，其中用“节点”（node）表示分子、靶蛋白，用“边”（edge）表示成分与靶点之间的关系。然后采用Network analyzer插件进行网络特征分析，以明确百合乌药汤中较为重要的成分和靶点，寻找重要候选基因。

1.5 治疗胃癌基因的蛋白互作和拓扑网络的构建 蛋白质相互作用网络主要借助BisoGenet和CytoNCA插件，其中Biso－Genet软件主要从以下数据库检索：Biological General Repository for Interaction Datasets(BioGRID)、Biomolecular Interaction Network Database(BIND)、Molecular Interaction Database(MINT)、Human Protein Reference Database(HPRD)、Database of Interacting Proteins(DIP）等。设置计算度中心性（DC）＞61，介度中心性（BC）＞600，筛选重要基因（标红的基因为候选基因）。获得的相关活性成分及靶点则有可能直接或间接调控这些节点发挥重要作用。

1.6 治疗胃癌基因GO富集分析 使用R软件对百合乌药汤治疗胃癌的基因进行GO富集分析。根据富集的数目和显著程度（p value阈值＜0.05，q value阈值＜0.05），取前20条富集过程，分别进行生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）、基因过程（molecular function，MF）的富集，绘制柱状图。

1.7 治疗胃癌基因KEGG富集分析及通路网络图的绘制 使用R软件，并安装插件DOSE、clusterProfiler、enrichplot、colorspace、stringi、ggplot2进行分析。根据基因富集的数目和显著程度（p value阈值＜0.05，q value阈值＜0.05）进行富集分析，取前20条KEGG通路，将得到的KEGG通路导入Cytoscape3.7.2，根据degree值大小，绘制通路基因网络图。

2 结 果

2.1 百合乌药汤活性成分与靶点 按照口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18，得到与胃癌相关的百合乌药汤活性成分16个，其中百合7个，乌药9个。Drugbank显示成分基因373个。（见表1）

表1 百合-乌药主要成分

2.2 胃癌GEO芯片差异分析GEO数据库下载GSE118916芯片与平台文件，获取有关正常胃黏膜与胃癌标本的芯片，分析两者中存在的差异表达基因。样本中正常对照组15个样本，肿瘤组15个样本。利用R软件及相关软件包对GSE118916表达谱数据进行过滤及标准化，筛选差异基因。差异基因筛选标准：使用R软件设定logFC绝对值＞1，矫正后P＜0.05，得出正常对照组与肿瘤组差异基因1 143个，分别取上调和下调最明显的前20个基因，分析并绘制热图与火山图。热图中横坐标为样本名称（正常对照组在前，肿瘤组在后），纵坐标为基因名称。绿色：低表达，黑色：中表达，红色：高表达。如差异基因FNDC1在肿瘤组高表达，在正常对照组低表达。（见图1）火山图中，横坐标中logFC＞0时，表示在肿瘤组上调。logFC＜0时，表示在肿瘤组下调。用颜色表示为，黑色：在正常对照组与肿瘤组无差异基因；绿色：在正常对照组上调，在肿瘤组下调；红色：在正常对照组下调，在肿瘤组上调。（见图2）

图1 正常对照组与胃癌患者差异基因热图

图2 正常对照组与胃癌患者差异基因火山图

2.3 百合乌药汤治疗胃癌的活性成分与作用靶点网络图 将百合乌药汤与胃癌差异基因取交集后，导入Cytoscape3.7.2，绘制分子基因网络图，根据不同靶点与有效成分对应关系的数目，进行分类展示。共得到潜在基因靶点31个，对应的有效成分10个。色原酮（Nubigenol、6,7-dimethoxy-2-(2-phenylethyl)、chromone）、豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPEC）、波尔定碱（Boldine）、去甲波尔定（Norboldine）、槲皮素（quercetin）、异松脂酸（Isopimaric acid）、去甲秋水仙碱（3-Demethylcolchicine）、谷固醇（beta-sitosterol），其中对应靶点较多的乌药的活性成分槲皮素（对应27个靶点）及对应活性成分较多的PTGS2（对应8个活性成分）、ADRB2（对应8个活性成分）可能为百合乌药汤治疗胃癌关键活性成分。（见图3）

图3 百合乌药汤治疗胃癌分子基因网络图

2.4 百合乌药汤治疗胃癌基因的蛋白互作网络与拓扑网络图 网络构建机体的内在调控往往是复杂的调控网络，多见于直接调控靶点或间接调控相结合的调控方式，蛋白互作网络则是为寻找直接或间接关系提供了可能[10]。将百合乌药汤与胃癌差异基因取交集后，导入Cytoscape3.7.2，绘制PPI网络图。（见图4）在分子基因网络图的基础上，使用Bisogenet和CytoNCA插件，设置计算度中心性（DC）＞61，介度中心性（BC）＞600，构建拓扑网络，共筛选出3个候选基因VCM1、HSPB1、MYC。可见VCM1、HSPB1、MYC靶点位于网络的核心位置，在蛋白互作网络中发挥着关键调控作用。（见图5）

图4 百合乌药汤靶点蛋白相互作用网络

图5 百合乌药汤治疗胃癌基因拓扑网络

2.5 百合乌药汤治疗胃癌基因GO富集分析 使用R软件，根据百合乌药汤治疗胃癌的基因进行GO富集分析。根据富集条目和显著程度，取前20条GO富集过程，分别绘制BP、CC、MF柱状图。GO富集分析可见，在生物过程方面，这些靶点涉及对脂多糖（response to lipopolysaccharide）、对细菌来源分子的反应（response to molecule of bacterial origin）、氧化应激反应（response to oxidative stress）、白细胞游走（leukocyte migration）、细胞外基质组织（extracellular matrix organization）、细胞外结构组织（extracellular structure organization）、对氧水平的反应（response to oxygen levels）等生物过程，在分子功能方面，靶点涉及细胞因子活性（cytokine activity）、整合素结合（integrin binding）、血红素结合（heme binding）、蛋白激酶调节活性（protein kinase regulator activity）、激酶调节活性（kinase regulator activity）等分子功能。在细胞组分方面，靶点涉及内质网腔（endoplasmic reticulum lumen）、膜筏（membrane raft）、膜微结构域（membrane microdomain）、膜区域（membrane region）、细胞的顶端部分（apical part of cell）、胶原蛋白-包含细胞外基质（collagen-containing extracellular matrix）等组分。（见图6~8）

图6 百合乌药汤治疗胃癌基因生物过程（BP）图

图7 百合乌药汤治疗胃癌基因细胞成分（CC）图

图8 百合乌药汤治疗胃癌基因分子功能（MF）图

2.6 百合乌药汤治疗胃癌基因KEGG富集分析及基因-通路网络图 使用R软件，根据基因富集的数目和显著程度（p value阈值＜0.05，q value阈值＜0.05）进行富集分析，共富集到34条通路关系。将KEGG通路导入Cytoscape3.7.2，取前20条通路。根据degree值大小，显示通路与基因的富集程度，绘制通路基因网络图。（见图9）其中AGE-RAGE信号通路（9个靶点29%），肿瘤坏死因子信号通路（9个靶点，29%），液体剪切应力和动脉粥样硬化（7个靶点，22%），IL-17信号通路（6个靶点，19%），NF-κB信号通路（6个靶点，19%），癌症中miRNA（7个靶点，22%），人类巨细胞病毒感染（6个靶点，19%），阿米巴病（6个，19%），EB病毒感染（5个，16%）等信号通路，对应的IL6、ICAM1、PRKCB、CCL2基因数目较多。

图9 通路与基因网络图

3 讨 论

中国作为胃癌的高发国家，在临床发现时常是中晚期，发病年龄以中老年居多[10]。随着病程的延长，胃癌多在寒邪凝滞的基础上有“癌毒”积热的临床表现[5]。一方面脾胃虚弱，气血亏虚，使正气虚损加重，另一方面阴虚化热，“癌毒”更炽，形成寒热错杂之证。百合乌药汤其辨证关键为寒热错杂，气机失调，在临床中常加减应用于胃癌的辨证用药，收效甚佳[11-12]。本文基于网络药理学，从分子机制角度，阐述百合乌药汤治疗胃癌的作用机制，为进一步研究提供理论参考。

本研究筛选得到百合乌药汤活性成分16个，10个成分具有潜在的治疗胃癌的作用。作用靶点较多的2个活性成分为槲皮素（27个靶点）和豆甾醇（5个靶点）[13-15]，其中关于槲皮素、豆甾醇作用于胃癌的相关机制分析的文献，也证实本研究的可行性。

构建拓扑网络，共筛选出3个候选基因VCM1、HSPB1、MYC。其中关于热休克蛋白（HSP）的研究发现，热休克蛋白浓度升高与大多数癌症类型的生存前景不佳有关[16]。HSP升高的意义在于其在介导肿瘤细胞内特性方面的重要作用。MYC是胃癌的一种癌基因，负责细胞过度生长，促进细胞周期调控、代谢和凋亡等基因的转录激活，并在胃癌中过度表达[17]。在一项胃癌细胞的研究中发现，MYC-调控基因的表达谱呈现出不同组织学亚型的胃癌细胞，在MYC调控的基因表达谱中，其共同特点为基因的改变，这一发现可能使MYC在胃癌的治疗中成为一新药靶点。

GO富集分析显示，百合乌药汤主要涉及脂多糖、氧化应激、血红素结合、蛋白激酶调节等方面。脂多糖（LPS）为革兰氏阴性杆菌外膜的组成部分，具有双重生物学作用，作为免疫分子可以刺激机体的天然免疫反应，激发机体免疫功能，在胃癌的发展中发挥巨大作用。研究发现脂多糖可通过NF-κB激活促进胃癌细胞PD-L1的表达[18]。槲皮素可通过诱导细胞周期阻滞和促进凋亡细胞死亡而抑制肿瘤的增殖。研究发现槲皮素可明显抑制LPS诱导的NO生成和诱导型一氧化氮合酶（INOS）的表达[19]。并通过抑制LPS来抑制NF-κB的激活。在氧化应激方面[20]，槲皮素可增加活性氧（ROS）的产生，降低线粒体膜电位水平，增加AGS细胞的凋亡细胞数，并通过凋亡细胞死亡降低细胞总活力。在血红素结合方面，研究表明斛皮素可引起血红素氧化酶-1（HO-1）mRNA和蛋白质水平显著升高[19]。豆甾醇则可通过抑制细胞迁移、细胞周期阻滞、线粒体介导凋亡和抑制JAK/STAT信号通路达到对人胃癌细胞的抗肿瘤作用[21]。

KEGG富集通路显示，百合乌药汤治疗胃癌主要涉及AGE-RAGE、TNF、IL-17、NF-κB等信号通路，以及癌症中miRNA、液体剪切应力和动脉粥样硬化、人类巨细胞病毒感染、EB病毒感染等。其相对应靶点基因以IL-6、ICAM1、PRKCB、CCL2为主。有研究发现IL-6是化疗耐药的关键因素。这些发现提示IL-6抑制剂的潜在治疗可应用于提高胃癌细胞对化疗的反应[22]。最新研究表明，在试图找出调控早期胃癌（EGC）的枢纽基因的研究中发现，ICAM1与胃癌的预后不良有关，因此ICAM1可能是ECG的一个有价值的预后和诊断生物标志物[23]。研究发现HSACIRC 0092306（一种新的环状RNA）能抑制MKN-45细胞miR-197-3p表达，促进肿瘤启动子蛋白激酶Cβ（PRKCB）的表达，从而加速胃癌的发展[24]。研究发现CCL2既能维持耐药癌细胞的耐药，又能使敏感的癌细胞产生耐药性，CCL2的敲除或自噬诱导成功地逆转了肿瘤细胞的耐药性，在化疗耐药的生物标志物和干预靶标上具有潜在价值[25]。在TNF-α信号通路在胃癌组织中的表达及其相互关系的研究中发现，细胞存活基因可上调TNF、TNFR2、Tradd、TRAF2、CFLIP和NFKB2，而细胞凋亡的介导因子如TNFR1和CASP3被下调[26]。其结果表明，TNF/TNFR2结合介导的细胞存活基因在GC中表达上调，有利于其促肿瘤作用，而CASP3和TNFR1等促凋亡基因表达下调，提示肿瘤细胞凋亡与细胞增殖过程不平衡。这个过程也可能受到复杂的miRNA调控网络的影响。EBV相关性胃癌（EBVaGC）约占胃癌全部病例的9%，EB病毒在胃癌的进展中具有重大作用[27]。在槲皮素治疗EB病毒相关性胃癌的研究中发现，槲皮素可诱导SNU719细胞的凋亡，对DNMT1和DNMT3A表达的完全抑制作用明显，提高了F启动子的使用频率，降低EB病毒的潜伏期，槲皮素有可能成为抗EBV和胃癌的抗病毒和抗肿瘤药物[28]。

本文基于网络药理学探讨百合乌药汤治疗胃癌靶点的相互网络关系，可有效显示其有效成分与疾病靶点的作用机制，为进一步实验提供更合理具体的指导。但是本研究也存在一定的局限性，药物有效成分筛选不全面，以及部分有效成分和信号通路有待进一步实验考证。