铁皮石斛的组织培养和快速无性繁殖

姜燕燕，李建民

(青海师范大学生命科学学院植物组织培养实验室，青海 西宁 810008)

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)，又叫黑节草，是兰科石斛属多年生草本植物，主要分布在浙江、云南及陕西省等地方。铁皮石斛的生长环境分为两类，一类是生长在丹霞地貌上，这类铁皮石斛对生长环境和气候条件要求苛刻，通常生长在通风阳光充足的地方，海拔高，分布均在400～1 200 m高处，相对湿度20%～80%，对于透光度没有要求；另一类是以云南、广西等省区为代表的生长在深山林区里的铁皮石斛，适于生长的温度为18～30 ℃，晚间温度为10～13 ℃，温差保持在10～15 ℃，常常附生于树上或岩石上，适于温暖、湿润和半阴的环境，不耐寒冷。

由于铁皮石斛具有很高的药用价值和经济价值，在民间有“救命仙草”的美誉，现代药理学研究已经表明铁皮石斛具有抗氧化、抗肿瘤、降低血糖、提高免疫力等诸多功效[1]。铁皮石斛是一类野生资源，因为人们过度采挖已经造成生境严重恶化，该种类濒临灭绝[2]，为了保护这一珍稀物种，近年来，国内外广泛开展了铁皮石斛组培快繁技术的研究，已经有很多通过组织培养的方法来培育大量的试管苗。所以，解决铁皮石斛资源紧缺问题的一个有效途径就是要进行人工栽培[3]。目前，铁皮石斛组织培养和快速繁殖的外植体主要有根尖[4]、种子[5，7]、茎段[8，9]等，本研究是以铁皮石斛的带节茎段为外植体，在前人研究的基础上以MS培养基为基本培养基[9～11]，通过不同种类和浓度的激素配比，选出各个阶段最适宜的培养基，从而探索铁皮石斛的快速繁殖的途径。

1 材料和方法

1.1 材料

由青海师范大学生命科学学院植物组培实验室提供的铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)植株。

1.2 方法

1.2.1 培养条件 实验中所有的培养基都为MS培养基为基本培养基，添加蔗糖30.0 g/L、酪蛋白0.3 g/L、琼脂7 g/L。培养基pH =5.8，121 ℃灭菌20 min。培养温度25.3(+2)℃，光照时间为16 h/d。空气湿度为39% RH。

1.2.2 外植体的获取和材料的灭菌 剪取长势良好，生长健壮，无病虫害的铁皮石斛的幼嫩枝条，用洗衣粉水洗涤，然后流水冲洗20 min，用吸水纸吸干，用剪刀将茎段切成长度为1～1.5 cm的带节小茎段，用70%酒精浸泡30～40 s，用无菌水冲洗2～3次，再用0.1%升汞消毒5～7 min，浸泡后用无菌水冲洗3～4次，待用。

1.2.3 无菌材料的培养 将消毒好的外植体，用剪刀剪掉药物浸透的茎段部分，然后将外植体接种在郭洪波等[12]研究的(MS+0.4 mg/LNAA+5 mg/L6-BA)培养基上，培养生长一致的无菌苗，每瓶培养基中接种3个带节茎段，接种后，观察腋芽的萌发及生长状况，统计污染率。

1.2.4 不定芽的诱导和增殖 待无菌苗生长稳定，不再受到污染，以6-BA、NAA、GA为3个因素，每个因素设计3个水平，采用L9(34)正交实验设计(见表1，2)每组处理接种10瓶，每瓶接种3个茎段，每天观察并记录不定芽的生长状况，统计不同处理的诱导出芽率和增殖系数。诱导率的计算公式为：诱导率(%)=诱导出芽苗数/未污染的接种数；丛生芽增殖系数的计算公式为：增值系数(%)=丛生苗数/接种外植体数。

1.2.5 不定芽的生根 待丛生苗长至2～3 cm时，转至生根培养基，加入不同浓度的NAA，分别为0.2、0.3和2 mg/L，IBA的浓度为0和1.5 mg/L，不同浓度进行随机搭配，每个处理接种3瓶，每瓶接3个，观察并记录不定芽生根的情况。15 d后统计生根率，从而选出最佳的激素配比。其中，计算生根率的公式为：生根率(%)=生根株数/接种的外植体数。

表1 不定芽的诱导

表2 不定芽的增殖

表3 不同种类激素对不定芽诱导作用效应的检验

2 结果与分析

2.1 无菌材料的培养

通过模仿郭洪波等[12]的实验，将消毒好的外植体接种到(MS+0.4 mg/LNAA+5 mg/L6-BA)的培养基上，获取实验所需的生长正常的带芽植株。

2.2 不同激素浓度及配比对不定芽诱导和增殖的影响

2.2.1 不同激素浓度及配比对不定芽诱导的影响 采用Excel 2010软件统计试验数据，并用SPSS 21.0软件进行方差分析。不同种类激素对不定芽诱导作用效应的检验结果见表3，由表3可知，因素B和C的P值分别为0.425和0.393，都大于0.05，那么这两个因素对实验结果的作用不显著，即NAA和GA对铁皮石斛不定芽的诱导率的影响作用不显著；因素A的P值为0.026，小于0.05，说明因素A对实验结果的作用显著，即6-BA对铁皮石斛不定芽的诱导率的影响作用显著，如图1所示，当6-BA的浓度较低时，少量出芽，生长速度缓慢，诱导率低。当6-BA的浓度达到2 mg/L时，诱导率达到92.9%。

对因素A下的三个水平进行多重比较，结果见表4，该表显示的是两两水平比较，其中，1～3的P值为0.135，大于0.05，说明因素A的水平1和3之间没有显著差异，水平1和2以及水平2和3的P值分别为0.027和0.014，都小于0.05，说明因素A在这两组水平之间有显著差异。

表4 6-BA不同浓度之间的比较

表5 不同种类和浓度激素的最佳组合

2.B

3.C

最佳组合中应先选择因素A，由表5可知，对A变量来说，水平2最佳，而因素B和C没有显著影响，但是最佳组合的选择取决于实验结果的取值方向，本实验的结果为铁皮石斛的诱导率，即越大越好，则最佳组合为A2B2C2，即2 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA+0.2 mg/LGA。

2.2.2 不同激素浓度及配比对不定芽增殖的影响

表6 不同种类激素对不定芽增殖作用效应的检验

表7 6-BA不同浓度之间的比较

表8 不同种类和浓度的最佳组合1.A

2.B

3.C

由表6的检验结果可知，因素B和因素C的P值分别为0.460和0.651，都大于0.05，那么这两个因素对实验结果的作用不显著，即NAA和6-BA对铁皮石斛不定芽的增殖的影响作用不显著；因素A的P值为0.028，小于0.05，说明因素A对实验结果的作用显著，即6-BA对铁皮石斛不定芽的增殖的影响作用显著，如图4，5所示，不定芽增殖系数较高，苗健壮。

对因素A下的三个水平进行多重比较，结果见表7，该表显示的是两两水平比较，其中，1～3的P值为0.104，大于0.05，说明因素A的水平1和3之间没有显著差异，水平1和2以及水平2和3的P值分别为0.015和0.034，都小于0.05，说明因素A在这两组水平之间有显著差异，即6-BA浓度较低时，增殖系数低，随着6-BA浓度的不断提高，不定芽的增殖系数逐渐升高，当6-BA浓度为1 mg/L时，不定芽的增殖系数较高，达4.01倍。

最佳组合中应先选择因素A，由表8可知，对A变量来说，水平2最佳，而因素B和C没有显著影响，但是最佳组合的选择取决于实验结果的取值方向，本实验的结果为铁皮石斛的增殖系数，即越大越好，则最佳组合为A2B2C2，即1 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA+0.2 mg/LGA。

2.3 不同激素浓度及配比对不定芽生根的影响

根据外植体不定芽的生根现象可以知道，如图5所示，在没有添加任何激素的情况下，不定芽只有少许生根，根细，生长缓慢；由表9可以知道，只添加NAA促进不定芽的生根，当NAA处于低浓度时，不定芽的生根率会随着其浓度的升高，逐渐升高；当NAA浓度达到0.3 mg/L时，丛生苗的生根率为88%，达到最大，如图6所示，生根较多，出现肉质根；当其浓度超过0.3 mg/L时，不定芽的生根率逐渐下降；IBA对不定芽的生根没有影响。

表9 不同种类的激素及浓度对丛生苗生根的影响

3 讨论

由前人的文献报道可知[9～11]，用于铁皮石斛组织培养的基本培养基大多数为MS，1/2 MS培养基，李莹等[13]研究了4种基本培养基(B5、N6、1/2MS、MS)对铁皮石斛不定芽诱导的影响，其中，MS和1/2 MS培养基的诱导率可达100%，但MS培养基中的幼芽叶片浓绿，平均芽长可以达到1. 73 cm，明显高于1 /2 MS培养基幼苗的平均芽长1. 45 cm。而B5、N6的芽诱导率较低，且幼芽长势明显不如MS培养基中的幼苗。所以，选取MS培养基为最佳基本培养基。

同时，激素的种类和浓度对铁皮石斛不定芽的诱导、增殖和生根有着重要的作用，该研究结果表明，6-BA对不定芽的诱导和增殖的影响作用显著，这与欧阳凡等[14]人的研究结果相同，另外当6-BA浓度达到2 mg/L时，不定芽的诱导率可达到92%，这与李莹等[13]人的研究结果是一样的，但不同的是，对于不定芽增殖系数来说，本实验最佳的6-BA浓度为1 mg/L，增殖系数达4.01，琚淑明等[15]人认为NAA对铁皮石斛不定芽的生根有很明显的促进作用，何俊平等[16]人认为，NAA浓度为0.2 mg/L时，生根效果较好，该实验却得出不定芽生根最佳的NAA浓度为0.3 mg/L。本实验结果仅仅是理论上对不同种类和浓度激素的最佳配比组合，且该结果也只成立于本实验条件范围内。

图1 不定芽的诱导

图3 丛生芽的增殖

图5 丛生苗的生根

图2 不定芽的诱导

图4 丛生芽的增殖