赵亚芳,李郁茹,陈玉民,赵玉升,罗 娟,张一凡,孔 慧,赵 琰*,屈会化
王不留行炭纳米类成分发现及其对小鼠酒精性肝损伤保护作用
赵亚芳1,李郁茹2,陈玉民1,赵玉升1,罗 娟1,张一凡1,孔 慧1,赵 琰1*,屈会化3*
1.北京中医药大学中医学院,北京 100029 2.北京中医药大学中药学院,北京 100029 3.北京中医药大学中医药研究院,北京 100029
以王不留行为碳源,从中发现了王不留行炭纳米类成分(nano-components,VSC-NCs),并评价其对小鼠酒精性肝损伤的保护作用。利用马弗炉高温煅烧出王不留行炭,并从中提取分离出VSC-NCs。利用透射电子显微镜、紫外-可见分光光谱、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、荧光光谱、X射线光电子能谱(XPS)分析对其进行表征鉴定。采用小鼠酒精性肝损伤模型,对肝脏进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,同时检测谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、总胆汁酸(total bile acid,TBA)的含量以及肝匀浆液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛的水平来评价VSC-NCs的保肝作用。表征分析结果显示VSC-NCs为类球型,粒径分布在1.20~5.10 nm,晶格间距为0.23 nm,其主要由C、N、O 3种元素组成,表面含有羰基、羟基等基团。动物实验结果表明VSC-NCs可以显著降低酒精诱导的肝损伤小鼠ALT、AST、TBA和ALP含量,同时显著提高SOD水平和降低丙二醛的水平,表明VSC-NCs可以提高机体清除氧自由基的能力,减少脂质过氧化物的产生,从而达到保肝作用。首次从王不留行炭中发现了VSC-NCs,并证实了其对酒精所造成的肝损伤有明显保护作用,这不仅表明了VSC-NCs可以作为治疗酒精性肝损伤的一种潜在药物,也为研究中药物质基础提供了一种全新思维方式。
王不留行炭;纳米类成分;酒精性肝损伤;保肝作用;谷丙转氨酶;谷草转氨酶;碱性磷酸酶;总胆汁酸;超氧化物歧化酶;丙二醛
酒精是仅次于高血压和吸烟造成疾病的主要危险因素之一,根据世界卫生组织(WHO)报道,全球饮酒人群数量高达20亿,其中滥用酒精超过750万人,据统计,临床中有4%~25%的疾病与饮酒有关[1],长期饮酒或者短期大量饮酒会导致酒精性肝损伤,甚者会引发脂肪肝、肝炎、肝硬化甚至肝癌[2],严重威胁人们的健康。酒精性肝损伤主要是乙醇及其衍生物代谢过程中直接或间接诱导的氧化应激、炎性介质和营养失衡等多种因素相互作用的结果。其中一个重要原因是酒精会导致活性氧的增加,诱导产生氧化应激,进而导致细胞因子失衡和免疫紊乱,诱发脂质过氧化物产生等一系列级联反应,进一步损伤肝细胞[3-4]。治疗酒精性肝损伤常规药物如糖皮质激素、美它多辛,有助于改善酒精中毒症状和行为异常,但长期使用这些药物会加重肝脏负担,加快病情恶化[5]。目前临床上尚无有效方法来阻止或者逆转由于酒精造成的肝损害,因此开发一种安全、有效的治疗药物是很有必要的。
纳米材料中的碳点是直径为1~10 nm类球形纳米颗粒,具有水溶性、低毒性、良好的生物相容性等优越的性质,被广泛应用于生物医学领域,如生物成像[6]、药物递送[7]、纳米探针[8]等。前期研究发现,不同前体(或制备方法不同)所制备出的碳点在尺寸和结构上存在一定差异[9-11],且同一种前体制备的碳点因其表面基团的丰度不同导致其有不同的生物活性,包括抗癌[12]、止血[13]、抗惊厥[14]、抗炎[15]、抗菌[16]、抗氧化[17]、降糖[18]等。中药炭药高温炭化过程与碳点制备工艺有很大的相似性,不同的中药制备前体、炮制温度不同,提取分离出的碳点粒径存在差异,可能影响生物活性,如荆芥穗碳点因炮制温度的不同而止血活性强弱有差异[19],不同温度下制备的荷叶碳点粒径大小、表面基团不同对其止血作用有影响[20]。前期本团队进行炭药物质基础研究时发现,炭药中有一种尺寸和元素组成类似于碳点的新物质,将其命名为纳米类成分(nano-components)。根据已出版文献,中药的碳点往往具有较好的活性,如绵马贯众碳点具有止血作用[21]、机油高温热解人发合成的碳点具有抗炎镇痛作用[22]、黄柏碳点可以改善银屑病样炎症[23]。因此,猜测纳米类成分极可能是王不留行炭药中的起效物质基础。
王不留行(VS)为石竹科麦蓝菜属植物麦蓝菜(Neck.) Garcke的干燥成熟种子,始载于《神农本草经》,具有活血通经、下乳消肿、利尿通淋的功效。古有“逢子必炒”的说法,且炮制方法多为清炒法,《金匮要略》记载王不留行炮制方法为“烧灰存性”,用于金疮的治疗,后世乃至现在却很少用王不留行烧炭治疗金疮,而在临床实践以及治疗肝病的专利中有关于王不留行或炒王不留行的相关应用[24-27],同时之前的实验数据显示无论是生王不留行[28]亦或是炒王不留行均具有抗氧化活性,且炮制后活性更佳[29],而酒精性肝损伤能够引起机体出现氧化应激损伤,这一点已经被大量的临床及药理实验所证实。
有研究认为“烧灰”是炭药最早的炮制标准,“存性”是炭药发挥药效的物质基础[30],为王不留行炭用提供了依据。基于前期研究基础,本研究从王不留行炭水溶液中发现并分离出新物质,将其命名为王不留行炭纳米类成分(nano-components,VSC-NCs)。利用低分辨透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)获取其形态大小、粒径分布及晶格间距等特征;利用紫外光谱(ultraviolet-visible spectroscopic spectra,UV-vis)、傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared,FT-IR)与荧光光谱(fluorescence spectroscopy,FL)等光学方法来分析该量子点的光学特征、表面化学基团信息;利用X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)分析获得碳量子点的表面组成和元素分析。通过建立小鼠酒精性肝损伤模型观察肝损伤生化指标、测定肝脏抗氧化能力来评价其对酒精性肝损伤的保护作用。
TecnaiG220透射电子显微镜(TEM),美国FEI公司;JEN-1230高分辨透射电子显微镜(HR-TEM),日本电子光学实验室;CECIL紫外分光光度计,英国Cambridge公司;ESCALAB 250X射线光电子能谱分析仪(XPS),美国Thermo Fisher Scientific公司;F-4500荧光分光光度计,日本Hitachi公司;JEN-1230傅立叶转换红外光谱仪,美国Thermo Fisher Scientific公司;AU-480全自动生化分析仪,美国贝克曼库尔特有限公司。
王不留行饮片,产地河北,批号200502005,经北京中医药大学赵琰教授鉴定,为石竹科麦蓝菜属植物麦蓝菜(Neck.) Garcke的干燥成熟种子,购自北京仟草中药饮片有限公司;透析膜,截留相对分子质量1000,购自北京瑞达恒辉科技发展有限公司;无水乙醇购自北京化学试剂公司;联苯双酯滴丸,批号H11020980,规格1.5 mg,北京协和药厂;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒(批号20210407)、丙二醛试剂盒(批号20210408)购自南京建成生物工程研究所;生理盐水购自石家庄四药有限公司;本实验用水均为去离子水。
SPF级雄性昆明小鼠36只,体质量为(30.0±2.0)g,购于北京斯贝福生物技术有限公司,质量合格证书编号SYXK(京)2020-0033。实验期间动物均饲养于同一环境下,保持室温(25±1)℃左右,空气湿度55%~65%,环境安静,动物随意进食水。本实验相关动物实验遵循北京中医药大学有关实验动物管理和使用的规定,均符合3R原则。
称取王不留行干燥药材350 g,放入坩埚中,用锡箔纸密封,加盖放入马弗炉中烧制,马弗炉程序升温如下:第1阶段5 min内升温到70 ℃,保持30 min,第2阶段25 min升温到350 ℃,保持1 h。烧制完成后,待冷却到室温后取出,并放入粉碎机中打成粉末。取60 g粉末,加入1800 mL去离子水,煎煮3次,每次1 h,放置室温后,先用滤纸粗滤,再用孔径为0.22 μm的微孔滤膜精滤,合并3次滤液,浓缩,然后将浓缩液透析72 h以上,直至透析膜内的溶液颜色无明显变化,将获取的VSC-NCs透析液放于4 ℃保存,待用。
TEM观察VSC-NCs的外貌形态和粒径分布,HR-TEM观察其晶格间距和超微结构,紫外分光光度计和荧光分光光度计分析VSC-NCs的光学特征;红外分光光度计分析VSC-NCs表面的官能团信息;XPS分析VSC-NCs中所含有元素及其配位信息。
结果表明(图1-a)VSC-NCs形状为类球形,在水中具有良好的分散度。(图1-b)显示,粒径分布在1.20~5.10 nm,主要集中在2.50 nm左右,HR-TEM的结果(图1-c)显示,VSC-NCs的晶格大小分布清晰可见,晶格间距为0.23 nm。
VSC-NCs的紫外吸收光谱(图1-d)所示,该纳米类成分在200 nm左右有微弱的紫外吸收,这可能是由于π-π*跃迁所导致。VSC-NCs的红外光谱(图1-e)显示,吸收峰分别为3439、2921、2360、1634、1033 cm−1,分析可知3439 cm−1峰可能为-O-H键,2921 cm−1可能为-C-H伸缩振动峰,2360 cm−1吸收峰可能为-C≡N键。1634 cm−1吸收峰可能为 -C=O键,1384 cm−1的强吸收可能为-C-N键,1033 cm−1的吸收可能为-C-O-C键伸缩振动引起的,可以得出VSC-NCs含有羰基、羟基等官能团。从VSC-NCs的荧光光谱图(图1-f)中可以看出,该纳米类成分的最大激发波长在371 nm左右,最大发射波长在460 nm左右。以硫酸奎宁作为参照物,计算VSC-NCs的荧光量子产率为2.08%。
利用XPS进一步研究VSC-NCs的元素组成及其配位情况。如图2-a所示,284.94、399.67、531.8 eV处有明显的峰,表明VSC-NCs主要由C(65.31%)、O(30.67%)和少量N(4.02%)元素组成。C1s谱带(图2-b)显示,284.28、285.85、287.61 eV 3个峰,分别对应于C-C/C=C、C-N、C=O键[14-15,31]。O1s谱带(图2-c)所示,530.83、532.28 eV 2个峰分别对应于C-O、C=O键[14-15]。N1s谱带(图2-d)显示,399.24、399.75 eV 2个峰分别对应于C-N-C、C=N键[21-22]。
a-TEM b-粒径分布 c-HR-TEM d-紫外光谱 e-红外光谱 f-荧光光谱
a-VSC-NCs元素峰图 b-碳 c-氧 d-氮
以硫酸奎宁[32]为参比物质,计算VSC-NCs的FQY[33],本实验测定的FQY为VSC-NCS的相对量子产率。荧光光谱扫描时激发波长(EX)与发射波长(EM)狭缝宽度均为10 nm,利用公式FQYNCs=FQYRNCsRNCs2/(RNCsR2)进行计算,其中表示发射光谱下的峰下面积,表示371 nm时的吸光度值,表示溶剂的折射率,NCs和R表示VSC-NCs和对照品。为了使重吸收效应最小化,R和NCs应该保证在0.05以下。
2.4.1 造模及给药 雄性昆明小鼠36只,随机分成6组,每组6只,分别为对照组、模型组、阳性药(联苯双酯滴丸,用时将滴丸研成细粉后配制成质量浓度为15 mg/mL的水溶液)组和VSC-NCs高、中、低剂量(5.00、2.50、1.25 mg/kg)组。高、中、低剂量组分别给予相对应质量浓度的VSC-NCs,阳性药组给予联苯双酯,剂量为150 mg/kg,给药体积均为0.01 mL/g,给药1 h后,除对照组给予去离子水外,其余各组按体质量0.01 mL/g剂量ig 50%酒精溶液,以上所有操作每天进行1次,连续给药21 d后取材,实验前12 h禁食不禁水,小鼠眼眶取血后,立即摘取肝组织,放入−80 ℃冰箱备用。
2.4.2 肝脏组织病理切片观察 小鼠处死后,取肝左叶同一部位组织块,立即置入4%多聚甲醛中固定留待病理检测,乙醇梯度脱水后进行石蜡包埋与HE染色,于光学显微镜下观察肝脏组织学特点。各组肝脏组织病理形态的结果如图3所示,对照组小鼠肝小叶结构完整,肝索排列规则,肝组织结构正常,肝细胞排列整齐、结构清晰,无炎性细胞,未出现变形和坏死;酒精模型组小鼠肝小叶结构模糊,排列紊乱,肝组织结构、肝细胞排列紊乱,中心区域周围有明显大小不一的脂肪变性和炎细胞浸润;VSC-NCs中剂量组小鼠肝组织结构、肝细胞排列较整齐,肝组织内炎性细胞、脂肪滴空泡较模型组有很大减轻;VSC-NCs高、低剂量组小鼠肝组织结构相对清晰,肝细胞排列相对整齐,炎性细胞、脂肪滴空泡较模型组显著减轻。病理切片结果表明,VSC-NCs高、中、低剂量组均可以一定程度上减轻酒精造成的肝损伤。
2.4.3 血清中生化指标检测 眼眶取血后,全血在室温下静置2 h,离心(3000 r/min、15 min),取血清,测定血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、总胆汁酸(total bile acid,TBA)的含量。VSC-NCs对酒精性肝损伤小鼠血清肝功指标的影响如表1所示,与对照组小鼠相比,酒精干预21 d后模型组小鼠血清ALT、AST、ALP、TBA含量均极显著性升高(<0.01),表明酒精性肝损伤小鼠模型构建成功。与模型组小鼠相比,阳性药组和VSC-NCs高、中、低剂量组能极显著性的降低模型小鼠血清中ALT、AST、TBA水平(<0.01);阳性药组和VSC-NCs高、中、低剂量组对ALP水平的降低也有一定的作用,差异具有统计学意义(<0.05、0.01)。结果表明,VSC-NCs能够减轻酒精诱导的肝损伤,有较好的肝保护作用,其中中剂量效果最好。
a-对照组 b-模型组 c-阳性药组 d-高剂量 e-中剂量 f-低剂量组 →炎性细胞 →脂肪空泡
表1 VSC-NCs对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALP、TBA水平的影响(, n = 6)
与对照组比较:##<0.01;与模型组比较:*<0.05**<0.01,表2同
##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as table 2
2.4.4 抗氧化水平的研究 剪取肝组织,用0.9%氯化钠溶液漂洗,滤纸吸干表面水分,置于10 mL的离心管中,加入9倍0.9%氯化钠溶液(肝组织质量与0.9%生理盐水溶液体积比为1∶9),用匀浆机打碎,离心(3000 r/min,15 min),取上清液,按照试剂盒说明测定肝匀浆中SOD和丙二醛的含量,统计实验数据并分析实验结果。
氧化应激是酒精性肝损伤发生发展的重要机制之一,通过进一步测定SOD和丙二醛的水平来评价VSC-NCs抗氧化能力。各组肝组织中SOD和丙二醛水平的比较如表2所示,与对照组相比,模型组小鼠肝组织中SOD的水平极显著性降低(<0.01),丙二醛含量极显著性升高(<0.01);与模型组相比,VSC-NCs高、中、低剂量组、阳性药组肝组织中SOD水平极显著性升高(<0.01),丙二醛含量极显著性降低(<0.01),结果表明,VSC-NCs能显著性地提高酒精性肝损伤小鼠肝脏中SOD水平,降低丙二醛的含量,具有很好的抗氧化能力。
表2 VSC-NCs对酒精性肝损伤小鼠肝脏中SOD和丙二醛水平的影响(,n = 6)
王不留行作为一种传统中药,有着悠久的应用历史,现代研究主要从原始植物中所含刺桐碱、黄酮苷等小分子来解释它的抗炎[34]、保肝[35]的生物活性。科研人员发现银纳米粒子尺寸对抗菌活性有一定影响[36],同时关于纳米粒子尺寸、结构对生物活性的影响也引起了业内深入探讨[37-38],而中药炭药因其制备方法不同,其粒径尺寸和官能团的不同,也会导致其生物活性的多样性,如黄柏炭制备的纳米颗粒不仅可以改善银屑病样炎症[23],也可以保护尖吻蝮蛇毒导致的急性肾损伤[39]。
本实验从纳米材料角度出发,首次从王不留行炭中发现纳米类成分,通过建立酒精性肝损伤的模型来评价VSC-NCs对酒精性肝损伤的保护作用,通过TEM鉴定为VSC-NCs。紫外光谱和荧光光谱结果显示VSC-NCs有荧光现象,QY为2.08%,FT-IR和XPS显示VSC-NCs发现其主要由C、O、N 3种元素组成,含有-C≡N键、-C=O键、-C-N键和 -C-O-C键,同时表面官能团丰富,如羰基、羟基等官能团,本研究中VSC-NCs丰富的官能团可能有利于增加生物活性。
实验结果[40]表明酒精性肝损伤模型中动物血清ALT、AST、ALP活性升高及TBA含量增加,病理组织分析显示肝组织结构破坏明显,甚至有肝细胞坏死。血清ALT、AST活性高低可以间接反映肝损伤程度,是目前最常用的肝功能生化指标。ALT主要存在于肝细胞浆内,AST主要存在于肝细胞线粒体内,当肝细胞破坏、细胞膜通透性增强时,血清ALT活性升高,AST活性增强[41-42]。实验结果表明,不同浓度的VSC-NCs干预能够显著降低小鼠血清ALT和AST的水平(<0.05),推测VSC-NCs能够减少肝细胞以及肝细胞线粒体的破坏,恢复细胞膜的通透性使血清ALT和AST含量减少,从而保护肝细胞。ALP是胆汁淤积的重要指标,当胆汁的生成或排出障碍时会损伤肝细胞[43],可评估肝损伤的严重程度。胆汁酸浓度的升高可促进ALP合成,无论肝内或者肝外胆道阻滞时,都会导致ALP含量升高[44]。TBA也是反应肝损伤的重要指标,且对肝损伤比较敏感。健康人TBA的含量极微,当肝细胞发生病变或患胆管疾病时可引起胆汁的代谢障碍,使进入血中的胆汁酸含量显著升高[45],在胆汁淤积的情况下,肝脏的抗氧化能力下降,有研究表明胆汁酸可通过破坏线粒体的呼吸功能产生过量的活性氧直接造成肝细胞的氧化损伤[46],而肝脏氧化应激损伤在胆汁淤积的状态下加重,氧化应激损伤是肝内胆汁淤积的重要病理损伤环节[47]。本研究结果发现,在酒精诱导后血清中ALP和TBA的含量显著增加,而在给药后发现ALP和TBA的含量显著降低,推测在酒精诱导下肝细胞受损造成肝内胆汁淤积以致肝损伤,VSC-NCs可能通过抗氧化应激保护肝细胞从而减轻胆汁淤积所造成的肝损伤。
肝脏是乙醇主要的代谢场所之一,肝细胞代谢乙醇时产生大量活性氧,氧化应激水平增高,SOD的消耗增加,造成脂质过氧化,引起肝损伤[48]。SOD活力的高低反映了机体清除氧自由基的能力,丙二醛是生物体脂质过氧化的标志物,也是终级脂质过氧化物,能间接反映机体细胞受氧自由基攻击的严重程度,华宝玉等[5]和魏芳等[49]发现经过药物治疗后,肝组织中SOD水平升高、丙二醛水平降低,氧化应激反应降低,肝损伤程度减轻。本研究给药组小鼠SOD的活力显著提高,而丙二醛的水平则显著下降,说明VSC-NCs通过抗氧化应激的作用改善肝损伤。
综上,本研究利用高温热解法成功制备并分离出了VSC-NCs,而且发现VSC-NCs能够通过抗氧化发挥对酒精性肝损伤保护作用,未来可能成为一种绿色、安全的治疗酒精性肝损伤的潜在药物。本研究为中药治疗酒精性肝损伤的临床应用提供了实验依据,为中药,尤其是炭药的相关研究提供了一种全新的思维方式。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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Discovery ofnano-components and their hepatoprotective effect in mice with alcoholic liver injury
ZHAO Ya-fang1, LI Yu-ru2, CHEN Yu-min1, ZHAO Yu-sheng1, LUO Juan1, ZHANG Yi-fan1, KONG Hui1, ZHAO Yan1, QU Hui-hua3
1.School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2.School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3.Institute of Chinese Medicine Research, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
Nano-components were discovered from(VSC) and explored their hepatoprotective effect on alcoholic liver injury in mice.The VSC was calcinated by muffle furnace at a high temperature.By filtration, extraction and dialysis of the decoction, a new water-soluble substance was obtained and named as VSC nano-components (VSC-NCs).The VSC-NCs were characterized by using transmission electron microscopy (TEM), UV-Vis spectroscopy (UV-Vis), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), fluorescence spectroscopy, X-are ray photoelectron spectroscopy (XPS) and other instruments and methods.According to the alcoholic liver injury model, performing hematoxylin-eosin (HE) staining on the liver and measuring alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP), total bile acid (TBA) and the levels of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) in liver homogenate are to evaluate protective effect on liver injury of VSC-NCs.Characterization results showed that VSC-NCs were spherical, uniformly distributed in particle size between 1.20—5.10 nm, with a lattice spacing of 0.23 nm.The VSC-NCs were mainly composed by C, N, O and the surface contained carbonyl and hydroxyl groups.The animal experiment results showed that VSC-NCs significantly reduced the content of ALT, AST, TBA and ALP in mice with alcohol-induced liver injury, and significantly increased the level of SOD and reduced the level of MDA.The results indicated that VSC-NCs can improve the body’s ability to scavenge oxygen free radicals and reduce the production of lipid peroxides, thereby protecting liver cells.The VSC-NCs were discovered fromfor the first time and proved that they have a significant protective effect on liver damage caused by alcohol.This not only shows that VSC-NCs can be used as a potential drug for the treatment of alcoholic liver injury, but also provides a new way of thinking for the qualitative basis of traditional Chinese medicine in research.
; nano-components; alcoholic liver injury;hepatoprotective effect; alanine aminotransferase; aspartate aminotransferase; alkaline phosphatase; total bile acid; superoxide dismutase; malondialdehyde
R283.6
A
0253 - 2670(2021)22 - 6825 - 09
10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.007
2021-06-04
中央高校基本科研业务费专项基金资助项目(2019-JYB-TD-001)
赵亚芳,女,硕士研究生,研究方向为中药炭药的物质基础研究。E-mail: zyf2640594023@163.com
通信作者:赵 琰(1973—),女,博士生导师,教授,研究方向为经典方剂的配伍与应用及中药炭药的物质基础研究。Tel: (010)64286705 E-mail: zhaoyandr@bucm.edu.cn
屈会化(1966—),男,博士生导师,教授,研究方向为中药炭药的物质基础研究。Tel: (010)64286705 E-mail: quhuihuadr@163.com
[责任编辑 郑礼胜]