基于网络药理学探讨平消片治疗胃癌的作用机制*

郭雪梅，马诗瑜，邱文超，陈柯村，汪 猛，秦凯健

（1.同济大学附属上海市第四人民医院，上海 200434；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海 200023；3.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437）

胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年尽管在诊断和治疗方面取得了进展，但胃癌患者的预后仍不理想[1]。中医药防治恶性肿瘤有其独特的思路与方法，多项研究表明，中西医结合治疗对于延长胃癌患者生存时间、减轻放化疗不良反应、改善生活质量均有一定贡献[2]。

平消片由郁金、马钱子粉、仙鹤草、五灵脂、白矾、硝石、干漆（制）、枳壳组成，是我国自主研发的抗肿瘤中成药，临床应用广泛。我国中医肿瘤专家贾堃创制了该组方，并将其用于治疗胃癌初起及病情进展患者[3]。中医肿瘤学者刘嘉湘[4]、孙桂芝[5]等也指出平消片可作为治疗胃癌的中成药之一。临床研究表明，该中药复方可有效增强放化疗疗效，降低放化疗毒副反应，提高肿瘤患者生存质量[6]。

网络药理学在数据库检索、高通量组学数据分析和计算机模拟等手段基础上，通过多层次网络构建及分析，实现药物作用机制预测等研究目的，其研究策略的整体性、系统性特点与中医学基于整体观去诊治疾病的理论不谋而合[7]。本研究旨在通过网络药理学方法探讨平消片在胃癌治疗中的作用机制，为实验和临床研究提供参考。

1 方 法

1.1 收集平消片治疗胃癌的靶点 使用ETCM数据库（参数：Tanimoto Scores＞0.8）[8]收集平消片的作用靶点。ETCM由中国中医科学院开发，数据库提供了方剂、中药及其成分的预测靶基因，可用于挖掘中药、方剂、成分、基因靶标、通路和疾病之间的网络关系。采用Uniport数据库[9]对预测靶点名称进行标准化。利用Metascape数据库[10]分析平消片靶点可作用的疾病类型。

使用DisGeNET数据库（参数：Score_gda≥0.3）[11]和Comparative Toxicogenomics Database数据库（参数：Inference Score≥40）[12]收集胃癌疾病的靶点。汇总、整理上述疾病靶点，并使用Uniprot数据库[9]对靶点名称进行标准化。

基于Venny2.1在线工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）和Metascape数据库[10]对平消片作用靶点和胃癌疾病靶点取交集，获得平消片治疗胃癌的潜在作用靶点。

1.2 作用靶点富集分析 基于潜在作用靶点，使用Metascape[10]进行GO和KEGG富集分析（参数：min overlap：3，P value cutoff：0.01，min enrichment：1.5）挖掘平消片治疗胃癌的作用机制。其中GO富集分析根据生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）类别对靶点进行注释和分类。MCODE（molecular complex detection）算法[13]也被用于识别密切关联的网络靶标并对结果进行富集分析。

1.3 构建靶点蛋白互作网络 基于STRING数据库对平消片抗胃癌靶点进行蛋白互作网络的构建（参数：interaction score≥0.40）[14]。利用Cytoscape 3.7.2软件（Cytohubba-MCC模块）获得核心靶标蛋白互作网络[15]。采用Metascape数据库（TRRUST模块）[10,16]挖掘平消片抗胃癌靶点的潜在转录因子。

1.4 肿瘤相关免疫细胞浸润分析 使用TIMER数据库（Gene module模块）[17]，分析核心靶点基因表达情况和不同免疫细胞丰度的关系，评估免疫细胞的浸润情况。

1.5 作用靶点临床意义及预后分析 使用GEPIA2数据库[18]，基于胃癌患者临床样本获取肿瘤和正常组织的基因表达情况，对平消片抗胃癌靶点进行主成分分析。同时，挖掘核心靶点在胃癌不同病理阶段的基因表达情况，及其对胃癌患者总生存期和无病生存期的影响，评估其预后价值。

2 结 果

2.1 平消片作用的疾病类型及其抗胃癌靶点 经筛选整理，共获取平消片作用靶点167个、胃癌疾病靶点1 063个。平消片作用的疾病类型依据P值排序，包括多种肿瘤及心理或情绪障碍等。（见图1）平消片作用靶点与胃癌疾病靶点的交集图显示有38个共同靶点，即平消片抗胃癌作用的潜在靶点。（见图2A）基于Metascape数据库将平消片作用靶点映射于胃癌疾病靶点，其中外圈红色代表胃癌靶点，蓝色代表平消片靶点；内圈深橙色弧及紫色连线，提示平消片与胃癌靶点重合情况；蓝色连线提示两者靶点的功能重合情况。（见图2B）

图1 平消片作用的疾病类型

图2 平消片与胃癌靶点的交集

2.2平消片抗胃癌作用靶点富集分析 富集分析表明，平消片的抗胃癌靶点涉及多种作用途径，分析结果依据P值排序。GO富集分析，经过筛选后发现包括调节脂质代谢过程（regulation of lipid metabolic process）、调节炎性反应（regulation of inflammatory response）、细胞对外界刺激的反应（cellular response to external stimulus）、氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）、丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）等。（见图3）KEGG富集分析，经过筛选后发现包括肿瘤microRNA（microRNAs in cancer）、IL-17通路（IL-17 signaling pathway）、花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）、Th17细胞分化（Th17 cell differentiation）等。（见图4）基于MCODE算法所识别靶点的富集分析结果，包括类泛素化修饰（SUMOylation）等，图中4个红点表示密切关联的网络靶标。（见图5、表1）

图3 平消片治疗胃癌靶点的GO富集分析

图4 平消片治疗胃癌靶点的KEGG富集分析

表1 基于MCODE算法识别的平消片抗胃癌靶点的富集分析

图5 基于MCODE算法识别的密切关联的平消片抗胃癌靶点网络

2.3 平消片抗胃癌靶点蛋白互作网络 平消片抗胃癌潜在靶点的蛋白互作网络包含38个节点和128个连线。（见图6）核心蛋白互作网络显示了平消片抗胃癌的核心靶点，包括PTGS2、AKT1、ESR1、NR3C1、AHR等。（见图7）同时，基于38个抗胃癌靶点挖掘了20个关键的转录因子，包括JUN、SP1、RELA、ESR1、NR3C1等。（见图8）

图6 平消片抗胃癌靶点的蛋白-蛋白互作网络

图7 平消片抗胃癌靶点的核心蛋白-蛋白互作网络

图8 与平消片抗胃癌靶点相关的20个关键转录因子

2.4肿瘤相关免疫细胞浸润丰度 核心靶点的基因表达水平与不同免疫细胞浸润丰度之间的相关性分析，差异有统计学意义（P＜0.05），结果提示核心靶点PTGS2、ESR1、NR3C1的表达水平与肿瘤纯度相关，核心靶点PTGS2、AKT1、ESR1、NR3C1、AHR的表达水平均与至少2种免疫细胞的浸润丰度相关。（见图9、表2）

图9 平消片抗胃癌核心靶点与免疫细胞浸润的相关性

表2 平消片抗胃癌核心靶点与免疫细胞浸润相关性的统计学意义

2.5 平消片抗胃癌靶点的临床意义及预后价值 平消片抗胃癌靶点主成分分析结果表明，靶点的基因表达情况在胃癌组织与正常组织之间有区分。（见图10）核心靶点在胃癌不同病理阶段的基因表达情况，其中Pr（＞F）＜0.05差异有统计学意义，结果提示ESR1、NR3C1、AHR在胃癌不同病理阶段表达有差异。（见图11）核心靶点的表达与胃癌患者总生存期、无病生存期的关系分析[风险比（hazard ratios，HR），LogrankP＜0.05差异有统计学意义]，结果提示PTGS2的表达与胃癌患者总生存期有相关性，ESR1、NR3C1的表达与胃癌患者总生存期、无病生存期有相关性。（见图12）

图10 基于肿瘤和正常组织的基因表达情况对平消片抗胃癌靶点进行主成分分析

图11 平消片抗胃癌核心靶点在不同病理阶段的基因表达情况

图12 平消片抗胃癌核心靶点对患者总生存期和无病生存期的预后价值

3 讨 论

平消片组方具有攻坚破积，解毒止痛、活血养血、健脾理气之效[3]，在肿瘤相关疾病的临床治疗中应用广泛。研究结果提示，平消片的靶点涉及多种肿瘤疾病，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、食管癌、子宫内膜癌、胃癌等。同时，平消片的作用还涉及心理或情绪障碍，包括自闭症、躁郁症和抑郁症等。肿瘤患者的心理痛苦是一个值得重视的问题，情绪调节是患者能够恢复健康的重要因素[19]。中医学自古就重视情志因素与疾病的关系，数据分析结果表明，平消片能发挥调节肿瘤患者心理情绪的作用。此外，平消片组方中含有中药郁金，具有清心解郁的功效，在精神、神经系统疾病等领域也有应用[20-21]。

富集分析结果表明，平消片通过参与多个生物途径发挥抗胃癌的作用。GO分析结果提示，平消片可以影响脂质代谢过程（regulation of lipid metabolic process）、炎性反应（regulation of inflammatory response）、细胞对外界刺激的反应（cellular response to external stimulus）、对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、透明质酸代谢（hyaluronan metabolic process）、细胞衰老（aging）、淋巴细胞的活化（lymphocyte activation）、上皮细胞分化（epithelial cell differentiation）、氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）、丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）等。KEGG分析结果提示，平消片可以影响肿瘤microRNA（microRNAs in cancer）、IL-17通路（IL-17 signaling pathway）、花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）、Th17细胞分化（Th17 cell differentiation）等。MCODE分析结果提示平消片可以影响类泛素化修饰（SUMO ylation）。上述生物途径和信号通路均与肿瘤的发生与进展有密切关系。如花生四烯酸代谢，在癌变过程中有重要作用，该途径中的代谢酶磷脂酶A2s（PLA2s）、环氧化酶（COXs）和脂氧合酶（LOXs），以及代谢产物如前列腺素和白三烯，已被视作肿瘤防治的新靶点[22]。再如SUMO化修饰是一种可逆的翻译后修饰，在调控基因表达、细胞信号转导和维护基因组完整性方面起着关键作用，广泛参与了DNA损伤修复、肿瘤细胞的增殖、转移和凋亡等，也是肿瘤治疗的潜在靶点[23]。

蛋白互作和核心靶点分析表明PTGS2、AKT1、ESR1、NR3C1、AHR等是平消片发挥抗胃癌作用的重要靶点。PTGS2（又称COX-2）是花生四烯酸转化为前列腺素过程中的一种关键酶，有研究报道了PTGS2在肿瘤发生发展、血管生成和转移中的作用，并与化疗耐药性密切相关[24]。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在肿瘤细胞葡萄糖代谢、细胞增殖和凋亡、细胞迁移等多种生物过程中发挥作用[25]。ESR1（estrogen receptor 1）编码雌激素受体α（ERα），该受体可通过多种途径与其他信号分子相互作用，如PI3K/Akt或MAPK信号通路等。ESR1突变最早报道于乳腺癌，在胃癌中，其与细胞增殖、转移和侵袭相关[26]。NR3C1在胃癌组织中甲基化程度较高，可能在胃癌发生发展过程中起重要作用[27]，且有研究报道了该基因的表达与胃癌肝转移相关[28]。AHR表达芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor），是一种配体依赖性激活的核受体，有研究表明其可以促进胃癌细胞增殖与侵袭[29]。此外，本研究基于平消片抗胃癌的靶点，挖掘了潜在的20个转录因子如JUN、STAT3、HDAC1、TP53、NFKB1、HIF1A等，其中ESR1、NR3C1等预测结果既是核心靶点，也是转录因子。平消片可以通过影响这些转录因子发挥抗胃癌作用。

富集分析结果提示平消片可以干预免疫细胞及炎性反应，因此进一步分析了肿瘤相关免疫细胞浸润情况，结果表明核心靶点的差异表达水平分别与多种免疫细胞（B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞）的丰度及肿瘤纯度相关，这也佐证了富集分析的结果。免疫细胞在肿瘤微环境中扮演着重要角色，其与肿瘤细胞相互影响，参与了肿瘤的发生、发展及转移。例如，肿瘤相关巨噬细胞可极化为M1型或M2型，其中M1型巨噬细胞具有较好的抗肿瘤能力，而肿瘤细胞分泌的多种因子可以促进巨噬细胞向M2型转化，同时，M2型巨噬细胞产生的细胞因子也可以促进肿瘤进展[30]。因此，调控巨噬细胞M2型向M1型转化，是抑制肿瘤进展的一个有效策略。

基于临床样本数据库，靶点主成分分析的结果表明，平消片可以通过调控数据挖掘所得潜在靶点发挥治疗胃癌的作用。核心靶点ESR1、NR3C1、AHR在胃癌不同病理阶段基因表达差异有统计学意义，且PTGS2、ESR1、NR3C1的差异表达与胃癌患者的临床预后有相关性，因此，平消片也可以作用于这些核心靶点影响胃癌患者临床预后。

综上所述，本研究基于网络药理学方法，获得了平消片治疗胃癌的潜在靶点，富集分析结果表明平消片可以通过影响脂质代谢、炎性反应、免疫、花生四烯酸代谢、SUMO化修饰等多种生物途径发挥抗胃癌功能，也可作用于PTGS2、AKT1、ESR1、NR3C1、AHR等核心靶点影响胃癌患者预后。平消片通过多途径、多靶点发挥抗胃癌作用的预测分析结果，为进一步研究提供了理论依据和线索。