伴失眠的肝肾阴虚型系统性红斑狼疮患者睡眠结构与Treg细胞、细胞因子的关系研究

胡晓辉，吕婷婷，刘春莹

（1.陕西中医药大学第一临床医学院，陕西 咸阳 712000；2.空军军医大学唐都医院，陕西 西安 710038；3.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种自身免疫性疾病，病变部位在全身结缔组织，且常多系统、多脏器受累。而SLE中医辨证类型较多，较常见的为热毒血瘀、肝肾阴虚、风湿痹阻及气血亏虚四型。其中，SLE病程后期以肝肾阴虚型多见，该型患者多伴有失眠。肾阴虚是引起失眠的重要病机，肝肾同源，故肝肾阴虚是导致失眠的关键所在。研究显示，外周血Treg细胞表达异常或者数量变化，引起体内T细胞和B细胞功能紊乱，导致过多自身抗体及细胞因子产生，最终引起SLE发病。而有关Treg细胞及细胞因子在肝肾阴虚型SLE患者表达及与其睡眠结构变化是否存在潜在的关系，查阅文献罕有报道。本文拟通过观察伴失眠的肝肾阴虚型SLE患者睡眠结构、Treg细胞、细胞因子表达变化，探讨研究肝肾阴虚型SLE患者免疫功能紊乱与失眠的关系，失眠程度与Treg细胞及细胞因子表达的相关性。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 诊断标准 依据美国风湿病学会（ACR）1997年推荐的SLE诊断标准及SLE疾病活动度评分（SLEDAI）标准[1]，并参照2002年国家药品监督管理局修订的《中药新药临床研究指导原则（试行）》[2]中SLE中医辨证标准。失眠西医诊断符合2001年《CCMD-3中国精神障碍分类与诊断标准》[3]中诊断标准，中医诊断符合1993年《中药新药临床研究指导原则（第一辑）》[4]中制定的失眠中医诊断标准。

1.2 纳入标准（1）符合以上所述西医诊断及中医证候标准的受试者；（2）年龄18～70周岁；（3）SLEDAI积分为非活动期患者（SLE-DAI≤10分）；（4）匹兹堡睡眠质量指数（Pittsburg sleep quality index，PSQI）总分＞7分；（5）入组前2周内没有相关镇静安神类药物服用史；（6）自愿参与本研究并签署知情同意书；（7）临床资料完备，并能接受定期随访。

1.3 排除标准 重度SLE活动型患者；合并其它风湿病或自身免疫性疾病者；合并各系统靶器官严重病变、血液病、肿瘤、各种急性感染及精神病等为非SLE所致者；合并认知功能障碍，无法完成PSQI测评者；不能耐受多导睡眠监测者；近半年内使用免疫抑制剂者；哺乳期或者妊娠期妇女；对本研究不能耐受者。

1.4 研究对象及分组 选取2018年7月至2019年9月在陕西中医药大学附属医院风湿肾病二科就诊的SLE患者63例，其中男11例，女52例；年龄35～70（50.92±7.88）岁。本研究通过陕西中医药大学附属医院伦理委员会的伦理审核，所有受试者均签署知情同意书。纳入患者分为3组：肝肾阴虚型SLE组（LKYD-SLE）、短期失眠肝肾阴虚型SLE组（SI-LKYD-SLE）、长期失眠肝肾阴虚型SLE组（LI-LKYD-SLE），各21例。其中，LKYD-SLE组不伴失眠，SLEDAI≤10分；SI-LKYD-SLE组失眠≤3个月，SLEDAI≤10分；LI-LKYD-SLE组失眠＞3个月，SLEDAI≤10分。

1.5 观察指标（1）测评PSQI、汉密尔顿焦虑量表（Hamilton anxiety scale，HAMA）、汉密尔顿抑郁量表（Hamilton depression scale，HAMD）、多导睡眠监测（PSG）相关睡眠参数（睡眠潜伏期、觉醒次数、觉醒时间、睡眠效率）。由固定的专业量表评定人员对入组患者进行PSQI、HAMA、HAMD评测，采用飞利浦伟康A6多导睡眠监测仪对入选受试者进行连续7 h夜间睡眠监测，记录睡眠参数。（2）检测外周血IgG、IgA、IgM、C3、C4、红细胞沉降率（ESR）水平。仪器采用西门子BNⅡ全自动蛋白分析仪，采集受试者空腹外周静脉血5 mL，离心提取血清，严格按照西门子BNⅡ全自动蛋白分析仪的SOP操作规程执行，运用散射速率免疫比浊法检测血清IgG、IgA、IgM、C3、C4含量，采用魏氏法检测外周血ESR。（3）检测Treg细胞表达。采用BD FACSAriaⅡ流式细胞仪和美国eBioscience公司提供的试剂，运用BD FACSDIVA 6软件分析Treg细胞的表达，空腹抽取受试者外周静脉血5 mL，肝素钠抗凝并提取外周血单个核细胞（PBMC），标记细胞内分子后清洗，采用流式细胞仪对Treg细胞（Foxp3+CD25highCD4+）进行检测。（4）检测外周血转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-10水平。采集受试者空腹外周静脉血5 mL，离心提取血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测外周血TGF-β、IL-6、IL-10含量，所用试剂为上海晶抗生物工程有限公司。

1.6 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据的处理分析，计量资料用“均数±标准差”（±s）表示，计数资料用例和率（%）表示。计量资料比较采用One-way ANOVA（单因素方差分析），组间两两比较采用LSD-t检验，计数资料比较采用χ2检验。P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基线资料3组患者基线资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。（见表1）

表1 3组患者基线资料比较

2.2 3组患者PSQI、HAMA、HAMD评分比较SI-LKYD-SLE组、LI-LKYD-SLE组患者PSQI、HAMA、HAMD评分均高于LKYD-SLE组患者（P＜0.01），且随着失眠时间增长，LI-LKYDSLE患者PSQI、HAMA、HAMD评分均高于SI-LKYD-SLE组患者（P＜0.01）。（见表2、图1）

表2 3组患者PSQI、HAMA、HAMD评分比较（±s，分）

表2 3组患者PSQI、HAMA、HAMD评分比较（±s，分）

注：与LKYD-SLE组比较，aP＜0.01；与SI-LKYD-SLE组比较，bP＜0.01

组别 例数 PSQI HAMA HAMD LI-LKYD-SLE组21 16.83±1.45b 17.81±2.85b 20.18±2.82b SI-LKYD-SLE组 21 11.15±1.63a 12.37±2.11a 12.73±2.36a LKYD-SLE组 21 4.91±1.20 6.22±1.42 6.70±1.52 F 381.5 149.3 188.1 P 0.000 0.000 0.000

图1 3组患者PSQI、HAMA、HAMD评分散点图

2.3 3组患者PSG监测睡眠潜伏期、觉醒次数、觉醒时间、睡眠效率比较SI-LKYD-SLE组、LI-LKYD-SLE组患者睡眠潜伏期、觉醒次数、觉醒时间均高于LKYD-SLE组（P＜0.01），并且随失眠时间增长，LI-LKYD-SLE组患者睡眠潜伏期、觉醒次数、觉醒时间均高于SI-LKYD-SLE组（P＜0.01）。相反，SI-LKYD-SLE组、LI-LKYD-SLE组 患 者 睡 眠 效 率 低 于LKYD-SLE组（P＜0.01），LI-LKYD-SLE组患者睡眠效率低于SI-LKYD-SLE组（P＜0.01）。（见表3、图2）

图2 3组患者PSG监测睡眠潜伏期、觉醒次数、觉醒时间、睡眠效率比较散点图

表3 3组患者PSG监测睡眠潜伏期、觉醒次数、觉醒时间、睡眠效率比较（±s）

表3 3组患者PSG监测睡眠潜伏期、觉醒次数、觉醒时间、睡眠效率比较（±s）

注：与LKYD-SLE组比较，aP＜0.01；与SI-LKYD-SLE组比较，bP＜0.01

组别 例数 睡眠潜伏期（min）觉醒次数（t）觉醒时间（min） 睡眠效率（%）LI-LKYD-SLE 组21 51.05±9.57b 8.5组21 38.05±7.45a 4.4 21 18.67±4.44 2.45±2.62b 57.52±9.37b 64.48±6.41b SI-LKYD-SLE3±1.70a 36.62±7.63a 78.52±5.11a LKYD-SLE组 6±1.15 20.05±5.1 88.90±4.59 F 100.2 58.58 103.2 107.3 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 3组患者外周血中IgG、IgA、IgM、C3、C4、ESR表达比较SILKYD-SLE组、LI-LKYD-SLE组患者IgG、IgA、IgM、ESR均高于LKYD-SLE组（P＜0.01），LI-LKYD-SLE组患者IgG、IgA、IgM、ESR显著高于SI-LKYD-SLE组（P＜0.01）。相反，SI-LKYDSLE组、LI-LKYD-SLE患者C3、C4均低于LKYD-SLE组（P＜0.01），LI-LKYD-SLE组患者C3、C4低于SI-LKYD-SLE组（P＜0.001）。（见表4、图3）

表4 3组患者外周血中IgG、IgA、IgM、C3、C4、ESR表达比较（±s）

表4 3组患者外周血中IgG、IgA、IgM、C3、C4、ESR表达比较（±s）

注：与LKYD-SLE组比较，aP＜0.01；与SI-LKYD-SLE组比较，bP＜0.01

组别 例数 IgG(g/L) IgA(g/L) IgM(g/L) C3(g/L) C4(g/L) ESR(mm/h)LI-LKYD-SLE组21 34.05±4.455.31±0.79 24.43±2.79a 3.88±0.65b b 2.45±0.51b 0.54±0.24b 0.26±0.08b 55.87±4.99b SI-LKYD-SLE组21a 1.66±0.37a 0.83±0.26a 0.47±0.10a 46.23±3.32a LKYD-SLE组 21 16.43±2.81 3.08±0.48 1.37±0.34 1.02±0.27 0.59±0.13 39.69±2.86 F 138.2 63.30 38.28 17.98 49.97 94.61 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图3 3组患者外周血中IgG、IgA、IgM、C3、C4、ESR表达比较散点图

2.5 3组患者外周血Treg、TGF-β、IL-10、IL-6比较SI-LKYDSLE组、LI-LKYD-SLE组患者Treg细胞、TGF-β低于LKYDSLE组（P＜0.01），且LI-LKYD-SLE组患者Treg细胞、TGF-β显著低于SI-LKYD-SLE组（P＜0.001）。相反，SI-LKYD-SLE组、LI-LKYD-SLE组患者IL-6、IL-10均高于LKYD-SLE组（P＜0.01），LI-LKYD-SLE组患者IL-6、IL-10均显著高于SI-LKYD-SLE组（P＜0.01）。（见表5、图4）

图4 3组患者外周血Treg、TGF-β、IL-10、IL-6比较散点图

表5 3组患者外周血Treg、TGF-β、IL-10、IL-6比较（±s）

表5 3组患者外周血Treg、TGF-β、IL-10、IL-6比较（±s）

注：与LKYD-SLE组比较，aP＜0.01；与SI-LKYD-SLE组比较，bP＜0.01

组别 例数Treg（%）TGF-β（pg/mL）IL-10（pg/mL）IL-6（pg/mL）LI-LKYD-SLE组21 2.85±0.33b 20.81±2.45b 19.44±1.69b 77.20±5.52b SI-LKYD-SLE组21 3.81±0.34a 25.15±2.56a 14.86±1.43a 61.07±4.86a LKYD-SLE组 21 5.02±0.46 34.48±3.76 11.17±1.27 50.05±4.08 F 170.9 115.2 166.0 166.0 P 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨 论

系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性结缔组织病，由于体内产生大量自身抗体，导致全身多组织多器官受累。有研究指出，SLE的发生涉及机体过多的自身抗体，由于T、B淋巴细胞功能异常活化发生免疫紊乱，大量免疫复合物在肾脏、关节等沉积，造成多系统多脏器损害[5-6]。中医典籍对于SLE并无准确记载，相关中医文献称之为“鬼脸疮”“日晒疮”，临床症状与SLE的蝶形红斑、光敏感及盘状红斑等有相似之处。SLE病因病机可能是以素体禀赋不足、肾精亏损为本，感受外界热毒之邪、瘀血阻滞为标，虚实互为因果，尤其育龄女性气火旺盛，多有阴虚内热，加之邪毒外袭，病久虚火灼津，阴血亏虚，故以肝肾阴虚为本，热毒瘀血为标[7-8]。且SLE活动期免疫反应亢进，以邪盛为主，多为血热加湿毒，缓解期免疫功能下降，多以正虚为主，辨证为肝肾阴虚、脾肾阳虚[9]，从而导致一系列多脏器受损、多器官功能障碍的临床表现。

中医学称失眠为“不寐”。《灵枢·大惑论》记载：“卫气不得入于阴，常留于阳，留于阳则阳气满，阳气盛则阳跷盛；不得入于阴则阴气虚，故目不瞑矣。”[10]传统中医理论指出，失眠是由于阳不交阴、阴阳失调所致。阴虚是诱发阴阳不交的主要原因，肾为先天之本，肾阴虚是引起失眠的重要病机，而肝肾同源，故肝肾阴虚是导致长期而顽固失眠的重要病机[11]。肝肾阴虚型失眠，多心烦易躁，伴自汗及盗汗，醒时烘热汗出，睡中盗汗，盗汗即醒[12]。由于SLE患者病程长，病情反复，生活节律被打乱，出现难以入睡而不得眠，醒后不易再睡，甚至彻夜不眠等失眠症状，推测与大脑皮层的兴奋和抑制调节功能失衡有关。SLE患者随着病情进展多出现失眠，会累及脏腑，导致功能障碍。

本研究结果显示，SI-LKYD-SLE组、LI-LKYD-SLE组患者PSQI、HAMA、HAMD评分均高于LKYD-SLE组（P＜0.01），尤其LI-LKYD-SLE组患者上述各项指标较SI-LKYD-SLE组明显增加（P＜0.001），提示随失眠时间延长，睡眠质量下降，患者焦虑抑郁情绪会明显加重。进一步PSG监测提示各肝肾阴虚型失眠组患者睡眠潜伏期、觉醒次数、觉醒时间发生异常，随失眠时间延长，睡眠效率明显下降（P＜0.01）。有研究指出，失眠症与焦虑障碍及抑郁症的共患率较高，其焦虑障碍患者伴睡眠紊乱、惊恐障碍和创伤后应激障碍的比例竟达70%[13-14]，提示失眠与焦虑抑郁障碍可能有相似的发病机制，因此存在着高度的共病特点。所以，伴有失眠的肝肾阴虚型系统性红斑狼疮患者在病程发展进程中，随着失眠时间的增加，睡眠质量及不良情绪均会明显加重。

研究报道，SLE相关免疫炎性因子表达的增多，与病情发展的程度相关，尤其IgG、IgA、IgM、ESR表达的增加与SLE发展严重程度有明确相关性，而C3、C4随着SLE严重程度的增加则会减少[15-16]。本试验中SI-LKYD-SLE、LI-LKYD-SLE组患者IgG、IgA、IgM、ESR含量均较LKYD-SLE组患者增高（P＜0.01），而C3、C4的表达则减少。与研究结果一致，失眠发生涉及多种体内炎性反应因子、神经体液多系统，长期失眠会引起机体免疫机能紊乱及失调，提示SLE患者失眠程度与免疫功能异常存在相关。研究证实，SLE患者初期气血亏虚，进展至后期出现肝肾阴虚，机体免疫功能下降，导致红细胞、白细胞、粒细胞、淋巴细胞及补体等减少[17]。并且，肝肾阴虚型SLE患者发展至后期，病情相对稳定，但体内多种炎性因子仍存在动态变化，随失眠时间的不断增加，睡眠质量相关参数、情绪因素及各种炎性因子表达会发生显著变化，与失眠的严重程度存在潜在关系。

近年研究指出，Treg淋巴细胞是T细胞家族一个新亚群，能够调控具有潜在伤害性的自身反应性T淋巴细胞，对病原体、异变细胞和机体异物具有防御、清除和识别的作用，对免疫反应有抑制作用[18]。Treg细胞参与SLE、肿瘤和类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的发病过程[19]。本试验显示，Treg细胞在不同失眠程度的肝肾阴虚型SLE患者中表达是不相同的，随失眠时间延长，Treg细胞数表达会减少，且Treg细胞与TGF-β可能存在促进作用，与IL-6、IL-10之间可能存在相互抑制的关系。其中，炎症因子IL-6、IL-10具有调节睡眠的作用，当睡眠结构紊乱时，IL-6、IL-10表达会增高，失眠时间越长，IL-6、IL-10表达越明显，而IL-6是B淋巴细胞分化因子，可诱导B淋巴细胞产生免疫球蛋白，其表达增高会干扰Treg细胞功能，使CD4+T淋巴细胞向Treg细胞转化减少[20]。有研究[21]指出，Treg细胞负性免疫调节作用是通过TGF-β抑制免疫细胞增生及Th1和Th2细胞的分化成熟，以及致炎因子IL-6、TGF-β等介导炎症细胞浸润而实现的。所以，体内Treg细胞数量变化、功能异常及细胞因子表达情况均与肝肾阴虚型SLE患者失眠程度存在一定关系。

总之，肝肾阴虚型SLE患者随着失眠时间的增加、失眠程度的加重，睡眠结构会发生改变，机体免疫紊乱程度愈加明显，Treg细胞及细胞因子表达愈异常。但机体免疫功能存在多种因素调节，Treg细胞及细胞因子参与SLE的发病，可能还存在其它T淋巴细胞或B淋巴细胞及细胞因子参与失眠相关肝肾阴虚型SLE的发生，仍需进一步研究。所以，肝肾阴虚型SLE患者免疫功能紊乱参与失眠发生，且失眠程度与Treg细胞及细胞因子存在潜在相关。