HPLC法同时测定乌药汤配方颗粒中4种成分的含量*

王瑞颖，易 柳，李 珊，高元峰，欧阳荣

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

乌药汤，最早出自于《兰室秘藏》（金·李东垣）[1]。方中乌药，散寒行气止痛，为君药；香附疏肝理气，调经止痛，加强乌药的治疗作用，当归养血活血，使行气活血而不伤血，共为臣药；木香行气止痛而消胀，为佐药；甘草缓急止痛，兼调诸药，为使药。诸药相合，共奏行气活血、调经止痛之功，使气行血畅，调经止痛[2-3]。该方2018年被收录于国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录（第一批）》。尽管乌药汤临床使用历史悠久，但有关乌药汤药效物质基础及质量控制方面的研究甚少。当前，乌药汤配方颗粒无质量标准，既不利于产品质量一致性的评价，也不利于产品更进一步的机理研究[4-5]。本实验采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定去甲异波尔定、阿魏酸、甘草苷、甘草酸单铵盐4个指标成分的含量，以期更好地控制乌药汤配方颗粒的质量。

1 仪器和试药

1.1 仪器Agilent1260高效液相色谱仪（含1260 Vialsamper，1260 Quat Pump，1260 MCT，1260 DAD WR，美国安捷伦公司）；LC1260安捷伦工作站；5424R高速低温离心机（美国Eppendrof公司）；AE2204高精度分析电子天平（湖南湘仪公司）；DYQC-30医用超声波清洗仪（连云港欧倍洁医疗设备有限公司）；XH-D振荡器（浙江天仪公司）。

1.2 试药 分析纯甲醇（含量99.9%，湖南汇虹试剂）；乙腈（色谱级，含量99.9%，美国Tedia公司）；甲醇（色谱级，含量99.9%，美国Tedia公司）；磷酸（色谱级，含量98.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三蒸水（医院自制纯化水）。对照品：去甲异波尔定（批号：wkq19013101，四川维克奇）、阿魏酸（批号：wkq19030705，四川维克奇）、甘草苷（批号：DST200412-009，德思特生物）、甘草酸单铵盐（批号：wkq19041108，四川维克奇）。乌药汤配方颗粒，组方中的5味药均来自江阴天江药业有限公司，包括乌药配方颗粒（批号：1811123，1911124和2011125）、当归配方颗粒（批号：1801115，1901114和2001116）、木香配方颗粒（批号：1805123，1905124和2005119）、香附配方颗粒（批号：1810114，1910110和2010115）、甘草配方颗粒（批号：1810154，1910152和2010201）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.5%磷酸，梯度洗脱；柱温：30℃；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min，进样量：20 μL。具体梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液配制 分别精密称取去甲异波尔定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸单铵盐对照品适量，置于10 mL定量瓶中，50%甲醇定容至刻度，摇匀，分别得到280、250、1 300、1 400 mg/L对照品标准溶液。

2.3 供试品溶液配制 按组方比例精密称取乌药汤配方颗粒共0.058 g，混匀，加入50%甲醇定容至1 mL，振荡，超声30 min，12 000 r/min离心10 min。取200 μL于1.5 mL离心管中，加入600 μL 50%甲醇，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.4 专属性试验 在“2.1”项色谱条件下，去甲异波尔定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸单铵盐保留时间分别为8.8、22.2、22.9、40.6 min，分离度良好，无其他成分干扰。（见图1）

图1 各成分HPLC色谱图

2.5 线性关系考察 精密称取“2.2”项下4种对照品标准溶液适量，分别按比例稀释，制备6种不同浓度的对照品溶液。在“2.1”项色谱条件下，进样20 μL测定。以峰面积为纵坐标（y），质量浓度为横坐标（x）进行回归，结果见表2，从中可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.6 精密度试验“2.2”项下对照品溶液，连续进样6次，在“2.1”项色谱条件下，进样20 μL测定，测得去甲异波尔定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸单铵盐峰面积RSD分别为0.05%、0.27%、0.11%、0.06%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取3份乌药汤配方颗粒，按“2.3”项下方法制备3种不同浓度的供试品溶液，室温下于0、1、2、4、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下测定，测得去甲异波尔定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸单铵盐峰面积RSD分别为0.32%、1.21%、0.21%和0.42%，表明这些溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验 取乌药汤配方颗粒，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样20 μL测定，测得去甲异波尔定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸单铵盐含有量RSD分别为0.58%、1.83%、0.45%、2.64%，表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 试验取已知含有量的乌药汤配方颗粒，加入适量对照品标准溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行6份，在“2.1”项色谱条件下测定，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n=6）

2.10 样品含量测定 按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，计算样品中去甲异波尔定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸单铵盐的含有量，结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果（mg/L，n=3）

3 讨 论

乌药汤具有疏肝解郁、行气活血、调经止痛功效，常用于治妇人血海疼痛，其疗效切确，临床上使用的历史悠久[6]。古代医书多有记载乌药汤的情况，其中《兰室秘藏》云：“乌药汤，治妇人血海疼痛。”[1，7]《素问·痿论篇》云：“阳气内动，发则心下崩、数溲血”[8]。《内科概要》云：“经前及经行腹痛，属瘀血挟逆气内阻。”《医宗金鉴·妇科心法要诀》说：“经前腹胀痛，乃血气凝滞。若胀过于痛，是气滞其血也，宜用加味乌药汤开之。”[9]从上述古典籍可以看出，自元代起便有用乌药汤缓解痛经，并延续至今。现代研究也发现，从乌药汤中能筛选出菜蓟苦素、金圣草（黄）素、甘草素等活性成分，这些成分能影响内分泌抵抗、雌激素受体信号传导通路和催乳激素信号通路。此外，乌药汤亦可为基础方，通过加味，治疗幽门螺杆菌阴性胃溃疡[10]、坐骨神经痛[11]、溃疡性结肠炎[12]、糖尿病胃轻瘫综合治疗[13]、小儿肠痉挛[14]、肝郁气滞型功能性消化不良[15]等疾病。本研究建立同时测定去甲异波尔定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸单铵盐含量的HPLC法，以期为乌药汤配方颗粒提供质量标准。

3.1 提取方法的选择 实验前期，提取剂考察中比较了甲醇、乙醚、正己烷、石油醚、50%甲醇和纯水的提取效果。其中，甲醇、乙醚提取液，溶剂峰过高、出峰少、峰型不好；正己烷、石油醚提取后杂质成分较多，分离度不高；而50%甲醇出峰数量合理，且能匹配出本实验测定的4种成分。提取时间和温度也分别进行了考查，对回流提取和超声提取两种方式进行了对比，差异不大，考虑操作方便快捷，最终选择50%甲醇30℃超声提取30 min，此方法提取效率高，溶剂峰影响小。

3.2 色谱柱及波长的选择 因供试品成分复杂，极性与非极性物质较多，笔者曾对Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent 5 HC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent 5 TC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）等不同的色谱柱进行考察，对比后发现其中Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），出峰时间合适，分离度较好且峰形优良。此外，笔者也进行190～360 nm全波长范围扫描，分别记录了去甲异波尔定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸单铵盐的光谱吸收情况，最终确定检测波长为280 nm。

3.3 流动相的选择 分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸和乙腈-0.05%磷酸等流动相体系。其中，甲醇-水体系，保留时间过长，检测效率低，且常出现基线上移的现象；乙腈-水体系，色谱峰出现分叉；最终选择乙腈-0.05%磷酸体系，其分离效果较好，出峰稳定、峰型尖锐。