六和汤对脾胃虚寒型胃溃疡大鼠的保护作用*

李小梅，鹿 伟，杜锦辉

（内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010030）

胃溃疡是一种临床常见的胃黏膜功能受损、胃组织病理出现炎症反应的多发性消化系统疾病。胃溃疡可发生溃疡出血、幽口梗阻、贫血及溃疡穿孔等多种并发症，严重危害人类健康[1-2]。目前，临床常用杀菌、抑酸及保护胃黏膜等西药治疗胃溃疡，但治疗效果不佳，复发率高，长期服用甚至出现耐药性，因此胃溃疡的治疗仍是现代医学的一大问题[3-4]。

中医学认为胃溃疡是由于正气虚弱、脾胃功能不足、脾胃自虚而引发的胃脘痛，而脾胃虚寒被认为是在各种胃溃疡类型中最为常见和高发的一种类型[5]。脾胃虚寒型胃溃疡主要病机为脾胃虚弱为本，瘀热内阻为标，实乃本虚标实、气血逆乱瘀滞之证，故中医常以行气活血，温中散寒治疗[6]。《太平惠民和剂局方》有记载“六和汤治心脾不调，气不升降，寒热交作，并伤寒阴阳不分，冒暑伏热烦闷，或成痢疾，并宜服之”。由此可见六和汤有健脾祛湿、升清降浊之功效[7-8]。因此，本研究通过动物实验，探讨了六和汤对脾胃虚寒型胃溃疡的保护作用及可能的作用机制，以期为胃溃疡的治疗提供新方法和思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康状况良好的SPF级SD雄性大鼠52只，4周龄，体质量80～100 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2016-0002。饲养于内蒙古医科大学动物实验中心，温度为18～25℃，相对湿度为40%～60%，自由饮水饮食，所有大鼠均采用断颈法进行处死，本实验经内蒙古医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂 番泻叶购于北京同仁堂药店（批号：180104002），番泻叶水煎剂制备方法为1 g番泻叶加入5 mL去离子水文火熬煮30 min，过滤药液，同样方法熬煮3次后合并药液，4℃保存备用。六和汤药物组成：白术15 g，茯苓15 g，人参10 g，半夏10 g，三七10 g，杏仁10 g，木瓜6 g，砂仁6 g，黄连6 g，木香6 g，甘草6 g。上述药材加10倍量水煎煮40 min，过滤后在药渣中加入8倍量水继续煎煮30 min后，过滤，将文火熬煮2次后的药液合并，兑入适宜的食用糖，并加热直至糖融化，4℃保存备用。阿司匹林肠溶片（石药集团欧意药业有限公司，批号：018150593）研磨后溶于去离子水中制成混合液，灌胃剂量为200 mg/kg。IL-6酶联免疫试验（ELISA）试剂盒（货号：K4145-100）、TNF-α酶联免疫试验（ELISA）试剂盒（货号：K1052-100）（美国Biovision公司）；MDA试剂盒（货号：A003-1）、SOD试剂盒（货号：A001-1-1）（南京建成工程研究所）；p-p38 MAPK兔抗鼠单克隆抗体（货号：9216S）、p-JNK兔抗鼠单克隆抗体（货号：9255S）（美国Cell Signaling Technology公司）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技术有限公司，货号：A0208）。

1.3 主要仪器MNT-150T型游标卡尺（德国美耐特公司）；Cytation3型酶标仪（美国BIOTEK公司）；Leica EG1150型组织包埋机（德国徕卡公司）；RM2235型组织切片机（德国徕卡公司）；PowerPac型电泳仪（美国BIO Rad公司）；1703940型转膜仪（美国BIO Rad公司）。

1.4 造模与分组52只大鼠适应性喂养7 d后，随机取13只大鼠作为正常对照组，其余39只大鼠，采用苦寒泻下和游泳力竭法建立脾胃虚寒型大鼠模型[5]，用番泻叶水煎液（1 g/mL）对造模大鼠进行灌胃，2 h后将各组大鼠放入装有常温自来水的50 cm深的水槽中游泳，使其整体没入水中3 s后立即捞起，连续7 d建立脾胃虚寒模型。第8天起对各组大鼠灌胃给予无水乙醇，1 h后再次灌胃给予阿司匹林（0.2 g/kg），连续5 d，建立脾胃虚寒胃溃疡大鼠模型，造模期间大鼠共死亡6只，随机取正常对照组及造模组大鼠各3只，病理切片结果显示造模组大鼠胃黏膜组织出现胃黏膜结构受损，皱皮增厚，出现溃疡、上皮细胞脱落及大量炎症细胞浸润的情况，则判断造模成功。造模成功后，将存活的30只模型大鼠随机分为模型组、六和汤高剂量组和六和汤低剂量组，每组10只。

1.5实验给药 灌胃方式给药，六和汤方中总生药量为100 g，根据人与大鼠体表面积计算公式得出大鼠每日生药量=总生药量/成人体质量（60 kg）×6.3，六和汤高、低剂量组大鼠分别灌胃给予六和汤42、10.50 g/kg，正常对照组和模型组灌胃等量冷开水，1次/d，连续14 d。

1.6 观察指标

1.6.1 一般症状和体征 实验期间，每天09:00:00定时观察各组大鼠一般情况（如活动状态、大便及毛发光泽度等情况），每周记录大鼠体质量、进食和饮水情况并检测肛温。

1.6.2 胃黏膜溃疡指数及溃疡抑制率测定 电子数显游标卡尺测量各组大鼠胃黏膜溃疡和糜烂部分，并采用Guth法计算其溃疡指数和抑制率[9]。溃疡抑制率（%）=[（模型组溃疡指数-给药组溃疡指数）/模型组溃疡指数]×100%。（见表1）

表1 溃疡指数评分标准

1.6.3 大鼠血清中炎症因子（IL-6、TNF-α）和氧化应激指标（MDA、SOD）的检测 给药结束后，麻醉各组大鼠，腹主动脉采血，在4℃离心条件下，12 000 r/min离心10 min，分离血清，置于-80℃保存备用。严格按照试剂盒说明书对血清中炎症因子和氧化应激指标进行检测。

1.6.4 大鼠胃黏膜组织病理切片 取出大鼠胃组织，生理盐水漂洗、滤纸吸干，转入4%多聚甲醛溶液浸泡固定48 h，脱水、包埋、切片、HE染色，镜下观察大鼠胃黏膜组织形态学改变。

1.6.5 Western blotting法检测胃组织MAPK信号通路相关蛋白表达 常规方法提取胃组织蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，加入β-actin一抗（1∶1 000）、p-JNK一抗（1∶1 000）、p-p38 MAPK一抗（1∶1 000），37℃，摇床摇匀4 h，1×TBST洗涤3次后加入HRP标记羊抗兔二抗（1:5 000），室温孵育1 h，1×TBST洗涤3次，最后在凝胶成像系统中显影，得到p-p38 MAPK、p-JNK条带，根据条带的灰度值计算蛋白表达量。

1.7 统计学方法 使用SPSS 25.0统计软件建立数据库并进行数据统计分析。计量资料采用（±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较，方差齐采用SNK-q检验，方差不齐采用Dunnett T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况 正常对照组大鼠动作反应灵敏，大便正常，体质量正常。与正常对照组比较，模型组大鼠反应迟钝，易扎堆聚集，大便较稀，体质量下降，肛温下降（P＜0.05）；与模型组比较，六和汤高、低剂量组大鼠便稀、扎堆聚集状况得到缓解，体质量和肛温明显增加（P＜0.05）；与六和汤低剂量组比较，六和汤高剂量组大鼠肛温明显升高（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠体质量及肛温变化（±s）

表2 各组大鼠体质量及肛温变化（±s）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与六和汤低剂量组比较，cP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（g/kg） 体质量（g） 肛温（℃）正常对照组 10 - 288.54±14.87 37.99±0.07模型组 10 - 232.33±13.71a 36.50±0.18a六和汤高剂量组 10 42.00 266.17±8.70b 37.55±0.16bc六和汤低剂量组 10 10.50 256.79±9.49b 37.30±0.15b

2.2 各组大鼠胃溃疡指数及溃疡抑制率比较 模型组大鼠溃疡指数明显高于正常对照组（P＜0.05）；六和汤高、低剂量组大鼠溃疡指数明显低于模型组（P＜0.05）；与六和汤低剂量组比较，六和汤高剂量组大鼠胃溃疡指数明显降低（P＜0.05）。六和汤高剂量组溃疡抑制率为71.62%，六和汤低剂量组溃疡抑制率为61.99%，提示六和汤对胃溃疡具有良好的抑制作用，高剂量的六和汤治疗效果优于低剂量六和汤。（见表3）

表3 各组大鼠溃疡指数及溃疡抑制率

2.3 各组大鼠胃黏膜组织病理变化 正常对照组大鼠胃黏膜结构完整，无上皮细胞脱落、溃疡和炎症细胞浸润；模型组大鼠胃黏膜结构受损，出现溃疡、上皮细胞脱落及大量炎症细胞浸润的情况；六和汤高剂量组大鼠胃黏膜结构较为完整，炎症细胞浸润和细胞脱落情况得到显著改善，六和汤低剂量组大鼠炎症细胞浸润得到改善，但大鼠胃黏膜结构存在一定的缺损，上皮细胞部分脱落。（见图1）

图1 各组大鼠胃黏膜组织病理变化（HE，×100）

2.4 各组大鼠血清炎症因子含量比较 模型组大鼠血清TNF-α、IL-6含量明显高于正常对照组（P＜0.05）；六和汤高、低剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6含量明显低于模型组（P＜0.05）；与六和汤低剂量组比较，六和汤高剂量组大鼠血清TNF-α明显降低（P＜0.05）。提示六和汤可降低炎症水平，高剂量六和汤效果更好。（见图2）

图2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6含量比较（±s，n=10）

2.5 各组大鼠血清MDA、SOD含量比较 模型组大鼠血清MDA含量明显高于正常对照组，而SOD含量明显低于正常对照组（P＜0.05）；六和汤高、低剂量组大鼠血清MDA含量明显低于模型组，而SOD含量高于模型组（P＜0.05）；与六和汤低剂量组比较，六和汤高剂量组大鼠血清MDA含量明显降低，SOD含量明显升高（P＜0.05）。提示六和汤可降低氧化应激水平，高剂量六和汤效果更好。（见图3）

图3 各组大鼠血清MDA、SOD含量比较（±s，n=10）

2.6 各组大鼠胃黏膜组织p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达情况比较 模型组大鼠胃黏膜组织p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达明显高于正常对照组（P＜0.05）；六和汤高、低剂量组大鼠胃黏膜组织p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达明显低于模型组（P＜0.05）；与六和汤低剂量组比较，六和汤高剂量组大鼠胃黏膜组织p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达明显降低（P＜0.05）。提示六和汤可抑制MAPK信号通路相关蛋白表达，高剂量六和汤效果更好。（见图4）

图4 各组大鼠胃黏膜组织p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达情况比较（±s，n=10）

3 讨 论

胃溃疡患者常见的临床症状为胃部疼痛或不适、胃胀和胃酸等，若治疗不及时可引发胃穿孔等而威胁患者生命。中医把胃部绵绵作痛或绞痛或者胀气痛归属“胃脘痛”的范畴。胃脘痛和人体自身的正气有关，寒邪犯胃或热邪犯胃都可以导致胃脘痛。六和汤中白术、茯苓、人参和甘草为四君子汤，有健脾益气之功效；半夏和杏仁味辛，有燥湿理脾的作用；木瓜与黄连起到温清除湿的效果；砂仁、木瓜及木香可起抑肝和胃、行气化湿、舒畅气机之功效；三七粉具有活血止痛、祛除血分瘀滞的作用。诸药合用，共奏健脾治本、除湿理气、行血之功[10]。

本研究中脾胃虚寒型胃溃疡大鼠反应迟钝，扎堆聚集，大便较稀，体质量下降，肛温下降。六和汤干预后，六和汤高、低剂量组大鼠便稀、扎堆聚集状况得到缓解，体质量和肛温明显增加，且溃疡指数均低于模型组大鼠，六和汤高剂量组溃疡抑制率达到71.62%，六和汤低剂量组溃疡抑制率为61.99%。胃黏膜组织病理学检查显示，模型组大鼠胃黏膜结构受损，出现溃疡、上皮细胞脱落及大量炎症细胞浸润的情况；六和汤高剂量组大鼠胃黏膜结构较为完整，炎症细胞浸润和细胞脱落情况得到显著改善；六和汤低剂量组大鼠炎症细胞浸润得到改善，部分上皮细胞脱落。与六和汤低剂量组比较，六和汤高剂量组大鼠肛温明显升高、溃疡指数明显降低。上述研究结果提示六和汤对胃黏膜有一定的保护作用，对胃溃疡有良好的抑制作用，高剂量六和汤的治疗效果优于低剂量六和汤。另外，病理结果提示，炎症可能参与了胃溃疡的发生发展。

胃溃疡的发生发展与胃黏膜侵袭因素和防御机理之间平衡密切相关。胃黏膜损伤修复过程涉及多种细胞因子和细胞外基质等[11]，其中炎症反应及氧化应激是引起胃溃疡发生的重要因素[12-13]。IL-6为诱发炎症细胞和免疫细胞生长和分化的趋化因子，可招募大量的炎症细胞，增加炎症因子水平[14]。TNF-α为单核细胞分泌，是机体损伤时早期出现的炎症因子[15]。IL-6和TNF-α在胃溃疡的发病机制和治疗中均发挥着至关重要的作用[16]。血清MDA是氧化损伤产物，SOD是机体重要的抗氧化酶，MDA和SOD的检测可准确反映机体的氧化应激情况，SOD含量越高，MDA含量越低，提示溃疡程度越轻[17]。大量的人群流行病学调查和动物实验均显示，炎症因子（IL-6、TNF-α）和氧化应激相关指标（MDA、SOD）水平与胃溃疡发生发展密切相关[18-20]。本研究同样发现，脾胃虚寒型胃溃疡大鼠IL-6、TNF-α、MDA含量明显增加，SOD含量明显降低。六和汤干预后，与模型组比较，六和汤高、低剂量组大鼠IL-6、TNF-α、MDA含量明显降低，SOD含量明显增加；与六和汤低剂量组比较，六和汤高剂量组大鼠血清TNF-α、MDA含量明显降低，SOD含量明显升高，说明六和汤能够降低脾胃虚寒型胃溃疡大鼠炎症反应和氧化损伤，对脾胃虚寒型胃溃疡大鼠起到保护作用，高剂量六和汤对改善脾胃虚寒型胃溃疡大鼠炎症反应和氧化损伤效果更好。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是一组结构内包含p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶及细胞外调控结构的蛋白激酶家族。p38 MAPK信号通路可被不良刺激如活性氧（reactive oxygen spe-cies，ROS）激活并介导炎症反应[21]。DIAO S L等[22]在探讨藏红花对动脉粥样硬化大鼠的影响发现，动脉粥样硬化大鼠血清SOD水平降低，MDA、IL-6、TNF-α水平，以及p38 MAPK的磷酸化水平明显升高，且炎症因子水平与p-p38 MAPK密切相关，而藏红花能减轻动脉粥样硬化大鼠血脂异常的作用机制可能与其抗氧化、下调p-p38 MAPK和抗炎作用有关。另有研究也发现，p38MAPK信号通路诱导巨噬细胞炎症反应与动脉粥样硬化的发生发展密切相关，其可能是治疗动脉粥样硬化的潜在干预靶点[23]。巩子汉等[24]发现白及多糖可下调JNK及p38 MAPK，抑制TNF-α、IL-6异常分泌从而对胃黏膜发挥保护作用。本研究发现，模型组大鼠胃黏膜组织p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达水平明显高于正常对照组，六和汤高、低剂量组大鼠胃黏膜组织p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达水平明显低于模型组；与六和汤低剂量组比较，六和汤高剂量组大鼠胃黏膜组织p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达明显降低。由此可见，MAPK信号通路参与了脾胃虚寒型胃溃疡的发生发展，六和汤可通过调控MAPK信号通路对其发挥保护作用，且高剂量六和汤效果更好。

综上，六和汤能够降低脾胃虚寒型胃溃疡大鼠炎症反应和氧化应激，对脾胃虚寒型胃溃疡大鼠起到保护作用，其机制可能与抑制MAPK信号通路有关，且高剂量六和汤效果更好。