SPOCK 家族生物学功能的研究进展*

陈 阳，万 波，周秀敏*

（1 苏州大学附属第一医院肿瘤科，苏州 215006；2 苏州大学神经科学研究所）

细胞外基质（extracellular matrix，ECW）是一种非细胞成分,分布在细胞表面或细胞之间；由弹性蛋白、胶原蛋白、非胶原蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖等组成；是组织和器官的重要组成部分。以往认为ECW仅仅是细胞、组织的静态支架,现逐渐意识到ECW也是调节细胞生存、增殖、极性、形状、迁移和代谢等活动的关键因素[1]。细胞外基质蛋白（matricellular proteins，WCPs）是一种ECW 非结构性分子,在ECW中不起支架作用,主要调节ECW 与细胞之间的相互作用。WCPs 含有不同的结构域,可与ECW、细胞表面受体、生长因子、细胞因子等相互作用,调节细胞内外分子信号的传递交流；也能够结合某些内在酶,从而调节ECW 的组装和降解[2]。当机体损伤后,基质成分的改变将直接影响组织的再生,所以WCPs 的改变将会影响某些疾病的发生发展。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted proteinacidic and rich in cysteine，SPARC）家族是有代表性的WCPs,每个SPARC家族成员都有相似的卵泡抑制素样结构域-钙结合区（follistatin-calcium-binding，FS-EC）结构域。

SPOCKs（SPARC/Osteonectin CWCV and Kazallike domains proteoglycan）作为SPARC 家族中的重要成员,是一种分泌性细胞外基质蛋白聚糖,与多种疾病的发生发展有关。SPOCK 家族主要由SPOCK1、SPOCK2 和SPOCK3 3 个成员组成。

1 SPOCKs 的分子结构及组织分布

1.1 SPOCKs 的分子结构 SPOCK1 最早是从人类精浆中分离出的一种蛋白聚糖,后在人睾丸和小鼠大脑组织中被克隆,又称睾素1（Testican-1）。SPOCK1基因定位于人5 号染色体长臂31 区域（5q31）,与IL9和EGR1 相邻,开放阅读框只有1.3 kb,编码439 个氨基酸序列,3′非翻译区异常长,为3.3 kb,可能调控mRNA 稳定性或蛋白翻译效率。C.VANNAHWE等[3]通过筛选该家族的人类cDNA 库,分离出一条与SPOCK1 同源的蛋白,称为Testican-2,即SPOCK2,SPOCK2 基因定位于人10 号染色体长臂22 区域（10q22）,mRNA 长度为6.1 kb,编码424 个氨基酸。U.HARTWANN 等[4]发现了SPOCK1 的另一个同源蛋白SPOCK3,SPOCK3 基因定位于人4 号染色体长臂32 区域（4q32）,编码433 个氨基酸。SPOCKs 在小鼠中分别称为Spock1、Spock2、Spock3。

SPOCK 家族蛋白氨基酸序列与骨连接素蛋白相近,其3 个成员基本结构相似,具有相似的N 端、C 端,以及中间的3 个区域:FS 结构域、EC 结构域和TY 结构域,并且在C 端具有糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）修饰位点。首先,作为分泌型蛋白,它们的N 端存在一段疏水氨基酸,作为分泌到细胞外的一种信号肽；后面是富含半胱氨酸的FS 结构域,涉及5 个二硫键桥,其中3 个二硫键桥位于Kazal 型结构域中,Kazal 型结构域在某些蛋白质中与丝氨酸蛋白酶抑制有关[5]。与FS 区域相邻的是由EF 环及α-螺旋组成紧密的球状结构,即EC 结构域,该区域与钙离子有较强的亲和力。C 端包含TY 结构域和结构域Ⅴ,半胱氨酸蛋白酶抑制剂、类胰岛素生长因子等多种蛋白质含有TY 结构域,是由3 个保守的二硫键形成的稳定短结构域,包含一个特有的CWCV 四肽序列。A.KRAJNC 等[6]验证了在SPOCKs 中FS-ECTY 三重结构域形成了一个中等致密的核心,促进细胞迁移。C 端结构是SPOCK 家族所特有的,包含两个GAG 修饰位点。在人类中,SPOCK2 和SPOCK3与SPOCK1 在氨基酸水平的同源性分别为45%和53%[7]。在单个Spock1 或Spock3 敲除小鼠中未观察到明显的表型变化,这提示它们可能在功能上是冗余的[8-9]。在某些结构上存在差异:SPOCK2、SPOCK3仅含硫酸肝素GAG,而SPOCK1 含硫酸软骨素GAG及硫酸肝素GAG,SPOCK2 有特定的N 型糖基化位点,因此它们在具体功能上存在一定的差异（图1）。

图1 SPOCK 家族蛋白的结构与功能示意图

1.2 SPOCKs 的组织分布 SPOCK1 在脑和前列腺中表达最丰富,在睾丸、肾脏、心脏等其他器官中也有表达。人的肝和肺中SPOCK1 含量极低。人脑中,SPOCK1 在丘脑、海马、枕叶、伏隔核、颞叶和尾状核表达最高,在大脑皮层、延髓、额叶、杏仁核、壳核、脊髓、黑质和小脑中表达稍低；其中,神经元细胞和脉络膜丛上皮细胞中表达较高[10]。SPCOK1 在发育早期调节神经发生和轴突生长,在发育后期广泛表达于发育中的突触域内[8]。SPOCK2 在人脑中有大量表达,在睾丸、肾脏中也有表达,与SPOCK1 不同的是,SPOCK2 可以在肺中检测到。脑切片原位杂交显示,SPOCK2 表达于大脑的大部分区域,包括嗅球、大脑皮层、海马、丘脑、小脑、桥脑和髓质等,在小脑中也有一定的分布[3]。SPOCK3 在人体中的表达分布与SPOCK1 相似[9]。

2 SPOCKs 的生物学功能

2.1 影响基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase，WWP）WWP 是降解ECW 的内肽酶家族之一,涉及许多生理事件和各种疾病的进展,包括癌症和炎症,可以作为疾病治疗的靶点。膜型WWP（membrane WWP，WT-WWP）是WWP 家族的一个亚群。SPOCK3的剪接变异体N-Tes 可抑制由WT1-WWP 及WT3-WWP 介导的WWP-2 的激活过程,关键序列位于N端信号肽之后的33～84 位氨基酸残基,SPOCK1 与SPOCK3 在该区域具有较高的同源性,所以具有相同的活性[11-12]。SPOCK2 不能抑制这些WT-WWPs,并且可以拮抗其他SPOCK 家族成员对WT-WWPs 的抑制作用[13]。研究[14-15]发现过表达SPOCK1 可以刺激WWP-2 和WWP-9 的表达和活性,从而降解ECW。

2.2 抑制溶酶体半胱氨酸蛋白酶L（cathepsin L，CTSL）CTSL 是一种蛋白水解酶,在人类多种癌症中常见上调,可促进肿瘤转移和侵袭。SPOCK1 是CTSL 的强竞争性抑制剂,SPOCK1 对CTSL 的抑制独立于其硫酸软骨素GAG 及硫酸肝素GAG,且在pH 5.5 和7.2 时有效,SPOCK1 对CTSL 的抑制作用依赖于TY 同源结构域[16]。SPOCK2 和SPOCK3 与SPOCK1 具有的相似的TY 结构域,推测它们可能也是CTSL 抑制剂。

2.3 激活上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EWT）EWT 过程是细胞由上皮细胞表型向间充质细胞表型的转变,参与胚胎发生、组织愈合、纤维化等生理和病理过程。同时,EWT 导致细胞之间的连接减弱,从而增强细胞运动能力和侵袭性,导致癌症的发生发展。EWT 过程是由EWT 诱导转录因子启动的,包括Zeb、Snail 和Slug 家族成员。一些信号通路也可以影响EWT 进程,在这些信号通路中,Wnt、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和Notch 被认为是EWT 表型的关键诱导剂。此外,上皮标志物（E-cadherin、N-cadherin）和间质标志物（Vimentin）是EWT 进程的重要标志。研究[17]表明,SPOCK1 通过上调N-cadherin、Snail、Vimentin 和Slug,下调E-cadherin,从而促进多种癌症的EWT 进展。关于SPOCK 家族其他成员与EWT 关系的相关研究暂未有报道,可能成为未来研究点之一。

3 SPOCKs 与各系统疾病的关系

3.1 消化系统疾病 肝纤维化组织中SPOCK1 的表达显著增加,过表达SPOCK1 通过激活整合素α5β1/PI3K/Akt 信号通路促进星状细胞的活化、增殖和迁移,从而促进肝纤维化,可作为肝纤维化治疗的候选分子靶点[18]。Y.LI 等[15]检测135 对肝细胞癌组织及邻近癌旁组织中的SPOCK1 mRNA 和蛋白水平,与癌旁组织相比,60%的肝细胞癌样本中SPOCK1 mRNA 和蛋白水平升高,总体和无病生存时间较短的患者SPOCK1 mRNA 水平升高。SPOCK1 可通过激活Akt,阻止细胞色素c 的释放,抑制肝癌细胞的凋亡,也可增强WWP-9 的表达与活性,使肝癌细胞更具侵袭性。

SPOCK1 通过增强Slug 介导的EWT 进程促进胃癌细胞的侵袭转移,且由于SPOCK1 介导的EWT过程,人表皮生长因子受体2 阳性胃癌细胞对拉帕替尼的耐药性增加[19-20],为预防和（或）克服患者的耐药提供了新的见解。同样,SPOCK1 直接受双链premiR-150 调控,双链pre-miR-150 的下调和SPOCK1的过表达能促进食管癌细胞的迁移和侵袭[21]。

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）细胞来源的TGF-β 可刺激SPOCK1 的表达,SPOCK1 通过影响ECW 的组成,使肿瘤细胞在体内侵袭性更强。SPOCK1 的下调显著降低PDAC 细胞的增殖和转移,促进PDAC 细胞周期阻滞,增加细胞的凋亡比率,所以SPOCK1 可作为一个潜在的诊断标志物或治疗靶标用于PDAC 的诊断和治疗[22]。通过差异表达分析获得影响PDAC 组织基质和免疫评分的90 个交叉基因,在这些基因中,SPOCK2 的表达增加与PDAC 患者的总生存率呈正相关,是良好预后基因之一[23]。

在胆囊癌中,SPOCK1 作为促癌基因激活PI3K/Akt 信号通路抑制癌细胞凋亡,促进癌细胞增殖和转移,并且SPOCK1 的表达水平随着胆囊癌的进展而升高,是一个潜在的胆囊癌诊断标志物或治疗靶标[24]。

SPOCK1 在结直肠癌组织中的表达高于癌旁组织,SPOCK1 表达上调也与肿瘤大小和TNW 分期相关,SPOCK1 表达下调可抑制结直肠癌细胞增殖,促进癌细胞凋亡,这些结果均显示SPOCK1 的表达与结直肠癌相关,可为结直肠癌的预防和治疗提供新的策略[25]。通过分析原发性肿瘤与正常癌旁组织的甲基化情况,发现SPOCK2 在结肠癌组织中高甲基化,可成为结肠癌诊断的候选生物标志物[26]。

3.2 呼吸系统疾病 通常认为产生表面活性剂的肺泡上皮Ⅱ型细胞（pulmonary alveolar epithelial typeⅡ，AT2）是肺泡Ⅰ型细胞（pulmonary alveolar epithelial type Ⅰ，AT1）的前体细胞,SPOCK2 的表达在AT2向AT1 细胞转化过程中随着时间的增加而逐渐上调,可作为AT2 转分化为AT1 细胞过程中特异性标志物之一[27]。支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早产儿最常见的慢性呼吸道疾病。A.HADCHOUEL 等[28]发现小鼠中Spock2 的过表达引起肺泡发育异常,并使高氧诱导的病变恶化,提示其在BPD 易感性中的作用。

SPOCK2 在病毒感染或干扰素诱导下表达,它被分泌到细胞外,直接阻止病毒的附着和侵入。流感病毒感染是由血凝素蛋白与呼吸道上皮细胞表面受体唾酸化的部分结合而引发的,含有唾酸化部分的硫酸肝素GAG 共价连接到SPOCK2 蛋白上,与细胞外的流感病毒结合,阻止病毒附着在细胞表面受体上,从而发挥抵抗流感病毒感染的作用。但流感病毒的神经氨酸酶可以裂解SPOCK2 的唾酸化部分,从而逃避SPOCK2 的抗病毒活性[29]。

SPOCK1 在肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,SPOCK1 在转移性肿瘤组织中的表达也明显增高。在上皮性肺癌细胞中,SPOCK1 作为TGF-β 的靶基因,可调节肺癌细胞EWT 过程[30]。而在肺癌细胞中下调SPOCK1 的表达,可抑制Wnt/β-catenin 通路的激活,从而显著降低肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,靶向SPOCK1 可能是肺癌治疗的新策略之一[31]。下调SPOCK1 可抑制奥希替尼耐药细胞的生长并克服耐药[32]。SPOCK2 与SPOCK1 不同,通过分析多个数据库发现与癌旁组织相比,肺腺癌中SPOCK2 显著下调,肿瘤浸润免疫细胞（tumor-infiltrating immune cells，TIICs）与肺腺癌患者的总生存率呈正相关,SPOCK2 影响肺腺癌中TIIC 的浸润水平和相对比例,高SPOCK2 表达水平与富集的CD4+T 细胞和巨噬细胞亚群呈正相关,预示着肺腺癌预后良好[33]。

3.3 泌尿生殖系统疾病 SPOCK1 高表达与前列腺癌和尿路上皮癌晚期临床病理特征及预后不良有关[34-35]。与SPOCK1 不同,前列腺癌组织中SPOCK2的表达明显降低,上调SPOCK2 基因的表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,阻滞细胞周期,作为抑癌基因发挥作用[36]。通过分析发现SPOCK3 基因在前列腺癌组织中表达也是下降的,且SPOCK3 高表达的患者可获得更长的无进展生存期[37]。

SPOCK1 在卵巢癌组织中表达明显升高,下调SPOCK1 可以显著抑制卵巢癌细胞OVCAR3 和SKOC3 的增殖和集落形成,在Spock1 缺失的小鼠组织中,卵巢肿瘤也更小,可能与细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）和Akt 信号通路有关,这些结果表明SPOCK1 是潜在的反映卵巢癌恶性程度的生物标志物之一[38]。SPOCK2 在卵巢癌晚期的表达水平明显高于早期,其表达水平的升高提示卵巢癌患者预后不良[39]。SPOCK2 蛋白在子宫内膜癌组织中的表达也明显低于正常内膜组织,上调SPOCK2 可通过调节WT1-WWP 和WWP2 蛋白的活性抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A 和Ishikawa 的增殖、侵袭和迁移,诱导细胞凋亡[40]。

3.4 神经精神系统疾病 R.DHAWIJA 等[41]报道一名有智力残疾伴运动障碍、构音障碍、胼胝体部分发育不全、产前小头畸形和房间隔缺损伴锁骨下动脉异常的女性患者,根据她及其父母的外显子测序显示,SPOCK1 有一个全新的错义突变,表明SPOCK1突变可能会引起神经系统发育异常。

蛋白表达分析显示,阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）患者额颞叶皮层SPOCK1 水平升高。组织学分析显示,SPOCK1 与突变的β-淀粉样前体蛋白（amyloid-β，Aβ）相互作用,聚集在AD 患者的额叶、颞叶和内嗅皮质,在β-淀粉样蛋白斑块形成过程中发挥重要作用[42]。在一项关于注意缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）和人格障碍（personality disorder，PD）的全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）研究中发现不同的SPOCK3 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）影响ADHD 和PD 的遗传风险[43]。

SPOCK1 在高度恶性胶质瘤的表达水平明显高于低度恶性的毛细胞性星形细胞瘤,说明SPOCK1在胶质瘤的发生发展中具有重要作用,可能与SPOCK1 激活PI3K/Akt 和Wnt/β-catenin 通路促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭有关,为临床治疗胶质瘤提供了潜在的理论基础[14]。此外,SPOCK1 还介导了高度恶性的多形性胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺的耐药性[44]。与之不同的是,分析由儿童和成人星形细胞瘤组成的微阵列数据集中的差异表达基因,发现在高级别脑胶质瘤中SPOCK2 为表达下调的基因[45]。

3.5 其他疾病 SPOCK1 可以调节乳腺癌EWT 进程,增强乳腺癌细胞的侵袭,SPOCK1 的高表达与乳腺癌的高分期和临床预后差呈正相关,可能是SPOCK1/SIX1 轴通过激活Akt/mTOR 通路加速乳腺癌细胞的增殖和转移来促进乳腺癌的进展,因此SPOCK1/SIX1 轴可作为预防乳腺癌进展的临床治疗靶点之一[46]。

SPOCK1 通过诱导口腔黏膜的EWT 变化从而促进口腔黏膜下纤维化[47]。也有研究[48]表示,过表达SPOCK1 有助于增强头颈部鳞状细胞癌的侵袭性。

骨肉瘤组织中SPOCK1 显著上调。SPOCK1 的过表达与肿瘤大小、转移、分期和病理程度有关,且下调SPOCK1 的表达可以抑制体外骨肉瘤细胞的生长,并降低裸鼠体内的致瘤性。SPOCK1 可能通过mTOR-S6K 信号通路促进骨肉瘤细胞的生长,为骨肉瘤的治疗策略提供新的方向[49]。

4 小结与展望

综上所述,SPOCK 家族影响多种疾病的发生发展过程（表1）。SPOCKs 虽具有相似的分子结构,但SPOCK1 主要作为癌基因影响着肝癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、前列腺癌等多种癌症的进展,SPOCK3也主要发挥癌基因作用,而SPOCK2 主要作为抑癌基因抑制肿瘤的发展。SPOCK 家族成员产生差异的具体机制及相关的信号通路仍需进一步探究。SPOCKs 广泛分布于脑组织中,与神经发育息息相关,也为以后研究神经发育障碍性疾病提供线索。越来越多SPOCK 家族在疾病中的研究被报道,提示该家族在相关疾病的早期诊断、预后判断以及治疗策略方面具有良好的前景。

表1 SPOCK 家族成员的分布、信号通路和相关疾病汇总