地衣芽孢杆菌KD-1β-甘露聚糖酶定点突变提高酶活性及稳定性

田庚 高伟强 陈晓波 张春晓

（河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018）

β-甘露聚糖酶，又名内切-1，4-β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78），通过随机水解甘露糖多聚物的β-1，4-糖苷键对甘露聚糖进行水解［1-2］。β-甘露聚糖酶在多种工业领域中都有所应用［3］，如作为饲料添加剂在养殖业中，通过降解抗营养因子β-甘露聚糖，提高饲料利用率［4］；在造纸工业，β-甘露聚糖酶能提高纸浆白度，改善纸浆性能［2，5］；应用于洗涤业，能够有效去除基于食品的染色［6］；应用于食品行业，能够防止面团的水分散失，维持面团的拉伸能力［7］，有效降低咖啡提取物的黏度［8-9］，对果汁进行澄清等［10-12］。此外，β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖的水解产物为，包含2-10个甘露单糖分子的线性和分支状寡甘露聚糖（MOS），作为功能性食品被应用于医药领域［13］。如MOS能够刺激肠道益生菌乳酸菌（Lactobacilli）和双歧杆菌（Bifidobacteria）的生长，抑制病源微生物的生长［2，14］，MOS还具有许多其它生物功能，如增强免疫、抗癌、维持心血管健康和增强脂肪代谢等［14-15］。

由于抗生素过量使用造成的潜在危害，全球多个国家已禁止或限制抗生素作为饲料添加剂使用，我国已于2020年7月全面禁止在动物养殖过程中使用抗生素作为饲料添加物。因此，研发抗生素替代产品尤为重要。β-甘露聚糖酶不仅能够提高饲料利用率，其水解产物MOS能够调节动物肠道健康，增强动物免疫力［4，13］，可作为良好的抗生素替代产品。尽管β-甘露聚糖酶广泛存在于植物、细菌、真菌和无脊椎动物中［1］，多种不同的β-甘露聚糖酶基因也已经克隆，不同酶的特征也做了鉴定［2，8，16-17］，但仍不能满足不同领域的精细化需求［2］，开发酶学活性高、稳定性高的β-甘露聚糖酶尤显重要。

来自于Bacillus lichenifromis DSM 13的β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶（GH）26家族，具有典型的（β/α）8 折叠结构，有浅盘状活性中心［18］，与来自于枯草芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶BCman（2qha）［19］和Bman26［2］具有相似的结构，具有很高的热稳定性［1，17］，在 50℃酶的半衰期超过 80 h［1］。本研究对来自于B. lichenifromis KD-1的β-甘露聚糖酶基因进行克隆，进行定点突变，以期获得酶学活性和稳定性提高的β-甘露聚糖酶。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和化学试剂 从土壤中分离得到B. licheniformis KD-1，目前保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号 CGMCC No. 18964。B.subtilis DB104 和质粒pWB980 为加拿大Wong教授所赠［20-21］，用于构建克隆载体的pGEMTeasy载体购自Promega公司，其他质粒列于表1，所用菌株列于表2。

表1 本研究中所用质粒Table 1 Plasmids used in this study

表2 本研究中所用菌株Table 2 Strains used in this study

应用全式金公司的Fastpfu或HifiTaq酶进行PCR扩增，所用引物见表3。

表3 本研究所用引物Table 3 Primes used in this study

1.1.2 培养基 培养B. licheniformis KD-1所用培养基为KGM培养基（KH2PO40.1%，MgSO40.01%，蛋白胨 0.5%，魔芋胶 0.5%，固体培养基额外添加1.5%的琼脂粉），B. subtilis 转化子的筛选为LB培养基中加入10 mg/L 的卡那霉素。枯草芽孢杆菌工程菌株的发酵培养基为SRM（super-rich medium，2.0%酵母粉，2.5%蛋白胨，0.3% K2HPO4和 3.0%葡萄糖）［2］。

1.2 方法

1.2.1 B. subtilis DB104感受态制备及转化 参考文献［22］进行枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备，1-2 μg PCR产物转化入0.5 mL感受态细胞中，用含卡那霉素的LB培养基进行转化子的筛选。

1.2.2 β-甘露聚糖酶基因分子克隆及B. subtilis DB104表达载体构建 根据已报道的地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因序列，设计简并引物Bl man2-F1和BL man2-R1，以B. licheniformis KD-1基因组为模板，克隆B. licheniformis KD-1 β-甘露聚糖酶基因manBl。纯化的PCR产物与pGEMTeasy载体连接，并送华大基因公司进行测序。构建manBl 基因在Bacillus subtilis DB104中的表达载体过程如下，应用BL man2-F2 和 manBT-2引物，以B. licheniformis KD-1基因组为模板，扩增不包含信号肽序列的manBl-sigP基因；以amyT-F 和amyT-R为引物扩增B.subtilis DB104 α-淀粉酶基因的终止子（amyT）；以等摩尔的manBl-sigP和amyT 为模板，以spmanB-F和amyT-R为引物，进行 manBl-sigP-amyT融合基因的扩增；以Pvf-1 和 Pvf-2p为引物对pWB980质粒进行线性化；将等摩尔的manBl-sigP-amyT和线性化的pWB980，通过POE-PCR方法［23］构建manBl在枯草芽孢杆菌中的表达载体pWB-manBl。

1.2.3 β-甘露聚糖酶基因理性突变及筛选 基于对ManB、BCman（2qha）和 Bman26三种β-甘露聚糖酶相似的三维结构［2，18-19］，参照Bman26获得的3个高酶活性突变体（K291E、L211I和 T112R）［2］，在相同的氨基酸位点对地衣芽孢杆菌KD-1的manBl基因进行理性突变。突变体ManBl（K291E）基因通过3步PCR克隆得到，第一步，通过引物R-manBl-F和 DR-manBl-R克隆基因的5′端；第二步，通过引物DR-manBl-F 和 R-manBl-R克隆该基因的3′端；第三步，通过引物R-manBl-F 和 R-manBl-R，以第一步和第二步获得的5′端和3′端PCR产物为模板，获得突变体manBl（K291E）基因。突变体ManBl（L211I）和manBl（T112R）采用相同的策略进行克隆，融合引物分别为BL-L211I-R和BL-L211I-F或 BL-T112R-R 和BL-T112R-F。载体的线性化以V-manBl-F和V-manBl-R为引物，pWB-manBl为模板，通过PCR克隆获得，PCR产物manBl（K291E），manBl（L211I）和 manBl（T112R）分别与线性化pWB-manBl载体通过POE-PCR进行连接［23］，获得相应的载体。manBl双位点突变基因K291E/L221I，K291E/T112R/和L211I/T112R采用上述相似策略获得。

1.2.4 工程菌株的发酵培养 对枯草芽孢杆菌工程菌株 MTV13、ABV3、T2、L4、LK2、TL1、TK7、A3和C5（表2）等，挑取单克隆至LB（含10 mg/L 的卡那霉素）培养基，37℃，200 r/min过夜培养，按10%比例转接至 SRM 培养基（含10 mg/L的卡那霉素），250 mL摇瓶发酵。

1.2.5 酶活性测定方法 采用3，5二硝基水杨酸的方法对β-甘露聚糖酶活性测定［24］，底物为0.5%（W/V）的魔芋胶（KGM），溶于pH 6.0的磷酸缓冲液中。适当稀释的酶液30 μL与 270 μL 的底物混匀，60℃ 孵育 10 min，加入600 μL DNS试剂混匀，煮沸5 min，立刻冰水浴中冷却10 min，在SpectraMaxm i3x多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）测540 nm吸收值。以不同浓度D-甘露糖做标准曲线。每组重复3次。

酶活性定义：在一定温度和pH下，以每分钟催化底物水解生成1 μmol D-甘露糖所需的酶量定义为一个酶活性单位（U）［1］。

1.2.6 酶的生物化学特征测定方法 将稀释的不同酶液与底物（0.5%KGM 于pH 6.0磷酸缓冲液）在不 同 温 度（30、40、50、55、60、65、70、80和90℃）反应10 min，测量残余酶活性，以确定酶反应的最适温度。将酶液用pH 6.0磷酸缓冲液适当稀释后，在70℃ 孵育 30 min，再按1.2.5方法测定酶活性，计算相对残余酶活性以确定酶的热稳定性［25］。

配制 pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0缓冲液，与等量粗酶液混合，在37℃条件下保温30 min。取出酶液使其与0.5% KGM混合，按1.2.5方法进行酶活性测定，计算相对残余酶活性以确定酶的pH稳定性［25］。

为了确定金属离子对酶活性的影响，将酶液用pH 6.0的磷酸缓冲液适当稀释后，分别与10 mmol/L K+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Na+、Cu2+和 Mg2+等 不 同 金属离子溶液等体积混合，在37℃条件下保温1 h，以未加金属离子的酶液作为对照［5］，再按1.2.5的方法测定β-甘露聚糖酶活性，计算相对残余酶活性以确定金属离子对酶活性的影响［25］。

为评估酶的动力学参数Km和Vmax，以溶于pH 6.0 的1-10 mg/mL KGM 作为底物，分别与适当稀释的酶液反应，按1.2.5方法测定酶活性［2］，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法计算Km和Vmax值。

1.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白浓度定量 枯草芽孢杆菌工程菌株目的基因表达与分泌采用SDSPAGE凝胶电泳进行检测，发酵后12 000 r/min 离心10 min，发酵液上清与5×上样缓冲液混合，煮沸10 min进行电泳。通过与标准蛋白比较条带面积及着色程度，应用AlphaView 软件（Naturegene Corp，USA）对目的蛋白进行定量。

1.2.8 蛋白纯化和定量 带有His标签的蛋白采用全式金蛋白纯化试剂盒按说明书进行纯化，纯化后蛋白采用Lowry蛋白测定试剂盒（索莱宝公司）按说明书进行蛋白定量。

1.2.9 manBl基因序列分析和蛋白结构分析 本研究的测序均送华大基因进行测序。manBl基因序列和蛋白质序列与GenBank 数据库进行BLAST比对。蛋白质的基本性质如分子量、等电点pI采用在线软件 Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/） 进行分析，采用 在线SignalP-5.0预测信号肽序列［26］。应用I-mutant 2.0在线软件预测突变株单个氨基酸替换后的DDG值［27］，应用在线Interpro进行蛋白质保守结构域的分析［28］。ManBl及其突变株蛋白四级结构应用在线SWISS MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）同源模型进行推断。

1.2.10 基因序列注册号 地衣芽孢杆菌KD-1β-甘露聚糖酶基因序列提交至GenBank，基因序列注册号为MW484945。

2 结果

2.1 基因克隆及序列分析

从B. licheniformis KD-1克隆的β-甘露聚糖酶基因（manBl）大小为1 083 bp，如图1泳道1所示。该序列在GenBank数据库中未找到与之100%一致的DNA序列，与B. licheniformis 其他菌株如ATCC14580（CP034569.1）、DSM13（AE017333.1）、KNU11（CP042252.1）和 CSL2（CP041154.1）等菌株存在99.8%（2个核苷酸差别）一致性，这2个核苷酸分别位于第11和1 074位，编码蛋白质的第4和358位的氨基酸。

图1 β-甘露聚糖酶PCR结果Fig. 1 The β-mannanase gene PCR product

manBl基因编码360个氨基酸，氨基酸序列BLAST结果表明，与B. licheniformis ATCC 14580或 DSM13、Bacillus sp. SL1等β-甘露聚糖酶一致性99.72%，经ProtParam软件预测，成熟蛋白分子量38.2 kD，pI为5.01。经SignalP-5.0软件预测，前24位氨基酸为信号肽序列，信号肽类型为Sec/SPI型。保守结构域分析该蛋白属于糖苷水解酶家族26（GH26），编码产物为内 1，4-β-糖苷酶（EC 3.2.1.78）。

2.2 manBl基因及其突变体在B. subtilis DB104中的表达

应用引物BL man2-F2 和 BL man2-R1克隆β-甘露聚糖酶成熟肽基因，PCR产物1 011 bp，如图1泳道2所示。β-甘露聚糖酶及其突变体基因受枯草芽孢杆菌组成型强启动子P43驱动，信号肽为SacB，各蛋白在B. subtilis DB104中的分泌表达如图2所示。结果表明，目的蛋白为发酵液中的主要蛋白，估测占总蛋白量的90%以上。

图2 β-甘露聚糖酶基因及突变体在枯草芽孢杆菌中的表达Fig. 2 β-mannanase gene and its variants expression in B.subtilis

2.3 β-甘露聚糖酶及其突变体的酶学性质

2.3.1 pH的影响 图3-A结果表明，ManBl及6个突变体K291E、L211I、T112R、T112R/L211I、L211I/K291E和T112R/K291E 的最适pH为6.0，所有突变体在pH 6.0-10.0之间pH稳定性高于野生型，残余酶活性超过78%，特别是突变株ManBl（K291E），展示出良好的碱稳定性，在pH 11.0时，残余酶活性还有76%，是一株较好的碱稳定性的酶。

2.3.2 温度的影响 ManBl 及6个突变体的最适温度为60和80℃时仍保留30%以上的酶活性（图3-B）。将ManBl 及6个突变体在70℃ 孵育30 min，酶的热稳定性如图3-C所示，ManBl三个单位点突变体T112R、L211I 和 K291E，酶的热稳定性降低，其中，ManBl（L211I）明显降低了酶的热稳定性，其稳定性仅为野生型ManBl的41%。包含L211I的3 个突变株，ManBl（L211I）、ManBl（L211I/K291E）和ManBl（T112R/L211I）残余相对酶活性分别为30%、31%和39%（图3-C）。

2.3.3 金属离子的影响 除ManBl（T112R）酶活性受到K+和 Cu2+激活外，ManBl及其5个突变体的酶活性均受到所研究的金属离子不同程度地抑制（图3-D）。

图3 β-甘露聚糖酶酶学性质研究Fig. 3 Properties of β-mannanase and its variants

2.3.4 β-甘露聚糖酶活性 β-甘露聚糖酶ManBl及其6个突变体酶活性在无添加金属离子、pH 6.0、60℃条件下进行比较，如图4-A表示，ManBl及其6个突变体酶活性前4 d持续积累，到第4天达到最高值（图4-A），第5天酶活性开始下降（数据未显示）。酶的突变体除ManBl（T112R/L211I）外，最大酶活性均高于野生型，其中突变体ManBl（K291E）酶活性为7 328.3±138.1 U/mL，是野生型的1.25倍；另外两个突变株，ManBl（L211I）和 ManBl（T112R/K291E）酶活性均超过6 800 U/mL。尽管单位点突变株 ManBl（T112R）和 ManBl（L211I）的酶活性较野生型高，但双突变体ManBl（T112R/L211I）酶活性反而较野生型下降（图4-A）。

由于受生长过程中细胞密度、目的蛋白分泌程度等各因素影响，单纯对酶活性（U/mL）测定并不能完全反应突变体的酶学性质，因此，进一步通过比活力对ManBl及其6个突变体进行比较。结果如图4-B所示，2个单位点突变株ManBl（K291E）和 ManBl（T112R），2个双位点突变株ManBl（L211I/K291E） 和 ManBl（T1122R/K291E），比活力均高于野生型ManBl（3 750±153.4）U/mg，其中T1122R/K291E和K291E是野生型的 2.60 和1.81倍，特异酶活性分别为（9 742±370.0）U/mg和（6 790±100.4）U/mg（图4-B）。3个单位点突变株T112、L211I 和 K291E的特异酶活性也较野生型ManBl有所提高。

图4 ManBl及突变体的酶活性Fig. 4 Enzyme activity of manBl and its variants

ManBl及6个突变株在与底物亲和能力方面表现也不同，表4为ManBl及6个突变体的Km及Vmax值。野生型ManBl 的Km值为3.80 mg/mL，突变株ManBl（T112R/K291E）比野生型ManBl有较低的Km（2.67 mg/mL），说明与底物亲和能力更高；其它突变株则在与底物亲和能力方面较野生型稍差（表 4）。除了突变体 ManBl（L211I）的 Vmax低于野生型之外，其他突变体的Vmax均高于野生型，其 中 突 变 体 ManBl（T112R/L211I） 的 Vmax最 大，为 0.951 μg/s。

表4 ManBl及其突变体的动力学参数Table 4 Kinetic parateters of ManBl and its variants

2.4 ManBl-His和ManBl（T112R/K291E）-His酶活性及热稳定性

为便于蛋白质的纯化，一般将蛋白质加上一些标签，如His标签等。本研究将野生型β-甘露聚糖酶ManBl和突变株ManBl（T112R/K291E）在C端加上6个His，纯化后进一步测定酶活性和热稳定性，纯化结果如图5所示，纯化后突变株ManBl（T112R/K291E）-His 的比活力为（2 283.8±49.6）U/mg，高于野生型ManBl-His的比活力（1 679.1±202）U/mg，均低于相应的不带His标签的ManBl（T112R/K291E）和ManBl；说明C端的His标签降低了酶活性。

图5 蛋白纯化结果Fig. 5 Protein purification results

本研究进一步比较了His标签对酶热稳定的影响，结果如图6所示。不带His标签的ManBl及ManBl（T112R/K291E）在70℃的热稳定性均高于相应的带有His标签的酶，ManBl 70℃半衰期为150 min，远高于其带His标签的酶ManBl-His的半衰期20 min（图 6）；另外，ManBl（T112R/K291E）70℃的半衰期80 min，虽低于ManBl的半衰期，但也远高于其带His标签的酶ManBl（T112R/K291E）-His 15 min（图6）。这些结果表明，C端His标签降低了酶的热稳定性。

图6 ManBl及其突变体的热稳定性Fig. 6 Thermal stability of ManBl and its mutants

3 讨论

通过基因突变对酶进行定向改造是一种快速获得酶学性质提高的有效方法［2，29］，如将B. subtilis TJ-102的β-甘露聚糖酶ManTJ102通过理性设计将酶的热稳定性提高了24倍，60℃半衰期达120 min［29］。基于对来自不同菌株的β-甘露聚糖酶结构分析，如地衣芽孢杆菌ManB［18］、枯草芽孢杆菌BCman（2qha）［19］和 Bman26［2］，尽管酶的氨基酸序列有差异，但三维结构相似。本研究对来自地衣芽孢杆菌KD-1菌株的ManBl基因进行了改造。结果表明，改造后的β-甘露聚糖酶突变体在酶活性、pH稳定性、热稳定性及与底物结合能力方面都发生了变化。应用I-mutant软件［27］对单氨基酸位点突变后DDG值的预测结果表明，L211I和K291E的DDG值分别为-1.29和-1.06，意味着这2个突变体 ManBl（L211I）和 ManBl（K291E）的热稳定性降低，与实验结果完全一致；尽管突变体ManBl（T112R）的DDG值为0.11，但实验结果表明该突变株的热稳定性并未增加。突变体β-甘露聚糖酶ManBl（K291E），不仅酶活性提高（6 789.6±100.4）U/mg，是野生型的1.8倍，且在中性至碱性pH范围（pH 7.0-11.0）内，突变体的pH稳定性远高于野生型，比从Klebsiella pneumoniae SS11中分离的碱和热稳定的β-甘露聚糖酶（ManSS11）的碱稳定性更好，其在pH 7.0-10.6之间残余相对酶活性大于70%，在pH 11.0时残余相对酶活性不到50%［6］，远低于本研究man（K291E）的碱稳定性；突变体ManBl（T112R/K291E）酶活性是野生型的2.6倍，且与底物亲和能力提高，热稳定性在70℃半衰期达80 min，pH 5.0-10.0之间具有良好的稳定性，pH 4.0环境下残余酶活性小于60%，该酶直接饲喂动物时受胃酸作用酶活性部分丧失，因此酶可对饲料进行预处理，或与菌协同作用制备发酵饲料。此外，突变体ManBl（T112R/K291E）虽然酶活性稍低于B.subtilis WL-7 的 β-甘露聚糖酶 10 080 U/mg［30］，但热稳定性远高于B. subtilis WL-7的β-甘露聚糖酶，其在 70℃ 1 h 残余酶活性不到 30%［30］。Zhou 等［31］比较了来自芽孢杆菌属的β-甘露聚糖酶性质，综合酶活性、热稳定和pH稳定性来看，地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体ManBl（T112R/K291E）在酶活性及稳定性方面高于其他β-甘露聚糖酶，展现了良好的工业应用潜力。

本研究中ManBl最适温度60℃，在80℃仍有50%的酶活性，且70℃孵育30 min后残余酶活性为73%，与来自B. licheniformis DSM13 β-甘露聚糖酶报道的最适温度50℃有一定差距，且当ManB1温度达到80℃已无酶活性，70℃ 保温30 min酶活性亦丧失［1］。经BLAST比对分析，B. licheniformis DSM13 β-甘露聚糖酶成熟肽氨基酸序列与本研究的KD-1菌株β-甘露聚糖酶序列一致，但是实验结果却存在如此大的差异。进一步分析发现，ManB在C末端加了6个His标签，为了验证是否His标签影响了β-甘露聚糖酶的性质，本研究将ManBl和ManBl（T112R/K291E）C末端加上了6个His做进一步分析。通过对ManBl-His和ManBl（T112R/K291E）-His的酶活性及70℃热稳定的测定，结果表明，His标签的确降低了酶活性和热稳定性。来源于B. subtilis Z-2的β-甘露聚糖酶结构及功能分析结果表明，N端His1和C端Glu336能够结合Zn2+，对酶的稳定性起重要作用［19］。Zn2+和 Ni2+也在 B. licheniformis DSM13的β-甘露聚糖酶中检测到，说明有相似的金属结合位点，对酶的热稳定性有影响［18］。β-甘露聚糖酶ManBl及ManBl（T112R/K291E）在C端加上His标签后，可能影响了Zn2+与蛋白的结合能力，导致酶活性和酶的热稳定性降低，因此在克隆表达通过金属离子稳定N端与C端结构的蛋白时，尽量避免在蛋白的N端或C端添加His标签。

4 结论

对来源于B. licheniformis KD-1 的β-甘露聚糖酶在T112、L211和K291三个位点分别进行单位点和双位点突变，获得了6个突变体，并在枯草芽孢杆菌中进行了分泌表达。ManBl和6个突变体具有相同的最适pH 6.0和最适温度60℃，所有突变体在pH 6.0-10.0稳定性均高于野生型，较野生型有更高的比活力。6个突变体中，ManBl（T112R/K291E）酶活性最高，为9 742.3 U/mg，是野生型的2.6倍，是热和碱稳定的β-甘露聚糖酶，能够适用于多个工业领域。