一种通用型生物解脂剂的制备

张琼月，熊 跃，李冰寒，李林辉

(西华师范大学生命科学学院，四川 南充 637009)

随着人们生活水平的不断改善，餐饮行业也随之欣欣向荣，但相关产业背后产生的油脂废水也不断增加。据统计，我国中大型城市每天产生的油脂废水可高达300多万t[1]，加之不正当、不合理的污水处理与废水排放，不合法的油脂废水回收再利用，对社会环境与生态环境、食品安全甚至人类安全都造成了极大的威胁[2-3]，油脂废水的合规处理与合理回收利用也成为社会各界关注的重点。

当下看来，处理油脂废水的主流方式包括物理法、化学法和生物法[4]三大类。其中物理法和化学法由于投资较大、占地面积广、流程复杂、且容易产生二次污染等不足，实际应用于大规模处理油脂废水的情况较少；而生物法因其处理过程成本低、效率高，且不产生二次污染等优点而深受业内人士青睐[5-6]。简言之，生物法处理油脂废水，即利用具有油脂降解能力的微生物，将油脂作为其生长发育所必需的碳源和能源，通过微生物生长过程中产生的脂肪酶等降解酶系，先将油脂初步水解为甘油、脂肪酸，最终分解氧化为无污染的水、二氧化碳等代谢产物，达到快速便捷分解处理油脂且不造成二次污染的最终目的。经过学者大量的筛选和验证实验可知[7-8]，蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)是一类具有分解油脂能力、分布广泛的微生物，常见于土壤、灰尘和污水当中[9]。蜡样芽孢杆菌能产生大量芽孢以抵御不良生长条件，环境合适时，芽孢又能快速萌发形成成熟的杆菌，产生大量脂肪酶分解利用环境中的脂类以满足生命活动所需。基于此种特性，蜡样芽胞杆菌满足制备干燥解脂剂所需要的保存时间久、活性恢复快、产物安全、无二次污染等一系列要求。

本文将实验室前期鉴定并保存的蜡样芽胞杆菌进行活化，在测定菌株解脂能力之后，制备成为具有高脂肪酶活性的解脂剂，在使用时只需要将解脂剂进行快速活化便可以大量投入使用，快速有效地降低油脂废水所带来的种种危害。本研究所关注的解脂微生物制剂的研究与制备，对于处理油脂废水、生态环境保护及其相关问题具有重要且深刻的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株 实验室保存的蜡样芽胞杆菌4号、7号。

1.1.2 培养基 LB固体培养基、LB液体培养基、解脂培养基(以10%体积的菜籽油替代LB液体培养基中的蛋白胨，且pH值调节至7.0)。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株解脂能力探究 将蜡样芽胞杆菌4号、7号菌株分别接种于LB固体培养基上，30℃活化培养；再转接至LB液体培养基中，以30℃、140r/min进行扩大培养。当测得菌株OD600值为0.3～0.6时[10]，分别接种1mL菌液于100mL解脂培养基中，30℃、140r/min振荡培养1d。观察对比上层油脂颜色变化，油脂颜色越浅说明菌株的解脂能力越强，选择解脂能力更强的菌株进行后续配制解脂剂的试验。

1.2.2 解脂剂配方筛选 干剂制备。将麸皮、谷壳按重量比10∶1的比例配制，调水至100%～120%，再分别添加重量比例为调水后麸皮谷壳重量1%、2%、3%、5%、10%的纯菜籽油进行搅拌并混合均匀。培养料以50g每份进行分装，121℃灭菌20min，冷却后用OD600值为0.3～0.6的菌液按0.1mL/g的比例进行接种，30℃恒温培养，期间每12h将培养料混匀1次，每24h取样检测脂肪酶活力，直至培养结束。培养完成后将培养料于40℃下烘干至恒重，密封避光保存备用即可。脂肪酶活力测定[11]。取1g培养料用无菌水振荡洗脱以获取酶液，采用指示剂滴定法测定其中脂肪酶的活力，计算公式如下[12]：U=(V-V0)/15×50×n其中U为样品的酶活力(u/g)；V为滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积(mL)；V0为滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积(mL)；n为稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 菌株解脂能力的初步判定

与空白对照组上层分布均匀的金黄色油脂相比，实验组上层油脂变为浅黄色，且下层培养基变浑浊。颜色的差异表明实验组的部分油脂被消耗，证明具有解脂能力的蜡样芽胞杆菌在培养过程中产生脂肪酶并分解了油脂，并且接种4号菌株的上层油脂颜色更浅，油脂被分解得更加充分，说明4号菌株的解脂能力强于7号菌株，故后续采用蜡样芽胞杆菌4号菌株进行解脂剂的制备。

图1 脂肪酶活力的测定结果

2.2 脂肪酶活性测定结果

根据测定结果来看，菜籽油的加入量为调水麸皮谷壳重量的5%时，解脂制剂的脂肪酶活性最为优异。从图1可知，菜籽油添加量为5%和10%的情况下，从第1天到第6天蜡样芽胞杆菌所产生脂肪酶的活性均呈现逐渐上升趋势，最高可达4399u/g；而其余3个试验组在培养5d后酶活便到达顶峰，虽耗时稍短但峰值较低，尚不足以达到制剂所需要的标准。总体来说，随着菜籽油添加量比例的增加，其配方更有益于蜡样芽胞杆菌生产脂肪酶，脂肪酶活性也越强；但分析可知，当油脂比例过高时，在一定程度上会影响菌株的生长，从而导致菌株产酶能力下降，故菜籽油添加量为10%时的总脂肪酶活力反而不如5%。

3 结论

解脂能力实验结果表明，蜡样芽胞杆菌具有解脂能力，且4号菌株更适宜用于制备解脂剂。添加不同比例菜籽油的配方实验结果表示，采用麸皮、谷壳重量比10∶1并调水至100%～120%，再添加5%菜籽油的配方，接种OD600值为0.3～0.6的蜡样芽胞杆菌菌液，在30℃下培养6d，再于40℃烘干至恒重，即可获得具有高脂肪酶活性的解脂剂，其最高活力可达4399u/g。在脂肪酶活性测定的实验中发现，油脂的添加在一定程度上可以促进解脂菌如蜡样芽胞杆菌的生长，但油脂比例过高反而使得其产脂肪酶能力下降，这也使得我们加深了对适度一词的理解。对环境的利用与保护也是紧紧联系着适度二字，只有全心全意地保护环境，才能得到大自然的美丽馈赠。