ZFP36互作蛋白基因OsGRP1的克隆及其在ABA诱导的抗氧化防护途径中的功能分析

陆秋萍,季锷,蒋明义

(南京农业大学生命科学学院,江苏 南京 210095)

ZFP36属于C2H2类型的锌指蛋白,已有研究证明其作为转录因子参与植株抗氧化防护以及在水稻抗稻瘟病过程中起重要作用[1-3]。以ZFP36为诱饵进行酵母双杂交筛库试验,将得到的结果进行序列比对,发现了1个互作蛋白OsGRP1。OsGRP1是富集甘氨酸蛋白(glycine-rich protein,GRP),在植物中富含甘氨酸蛋白质的特点是存在半重复的富含甘氨酸的基序[4]。一般来说,这些基因呈现出发育调控和组织特异的表达模式[5]。在一些植物中,它们的表达也受到生物和非生物因素的调控。

植物GRP的分类是基于其一般结构,再考虑甘氨酸重复的排列以及保守基团的存在[6]。Ⅰ类GRP可能包含1个信号肽和1个高甘氨酸含量区域,有(GGX)n重复[7]。Ⅱ类GRP也可能包含1个信号肽,并含有1个特征性的富含半胱氨酸的C末端。Ⅲ类GRP可能含有1个信号肽,并且与其他类别相比,含有较低的甘氨酸含量。在这些蛋白质中,油素域是这一子群的标志性基团[8]。Ⅳ类GRP又称为RNA结合型GRP,除了富含甘氨酸的域外,它们还存在1个RNA识别基序(RRM)或1个冷休克结构域(CSD),它们的结构中还可能存在CCHC锌指结构[9]。根据不同的域排列,Ⅳ类GRP又分为Ⅳa(除富含甘氨酸域外,还含有1个RRM基团)、Ⅳb(1个RRM和1个CCHC锌指)、Ⅳc(1个冷休克域和2个或更多锌指域)和Ⅳd(2个RRM)[10-11]。此外,在桉树属基因组中还发现了1组具有高甘氨酸含量但具有混合重复模式的GRP,也存在于拟南芥和水稻基因组中,因此提出了一类新的GRP(第Ⅴ类)[12]。

根据已有研究和BLAST蛋白序列比对,我们发现OsGRP1与拟南芥中At3g20470、At5g07530、At4g36020和At4g368680同源,At3g20470属于Ⅰ类GRP,与植物细胞伸长相关,At5g07530属于Ⅲ类GRP,在花药的授粉竞争中发挥作用[13],At4g36020和At4g368680均属于Ⅳc类GRP,在冷胁迫、离子和渗透胁迫中起作用[14-16]。OsGRP1与拟南芥中At3g20470、At5g07530的亲缘关系更近。

植物激素脱落酸(abscisic acid,ABA)参与植物生长发育的各个方面,包括种子成熟与休眠、植物开花与果实成熟等[17-20]。ZFP36参与了ABA诱导的抗氧化防护途径[21],通过影响CAT、SOD等抗氧化防护酶以及NADPH氧化酶活性参与到维护植物氧化还原内稳态中[22]。已证明ZFP36和OsGRP1互作的真实性,ZFP36在ABA诱导的抗氧化防护途径中如此重要[23],且OsGRP1与Ⅳc类GRP的亲缘关系相近,那么OsGRP1是否会在ABA诱导的抗逆过程中发挥作用?本试验采用ABA、H2O2、NaCl模拟离子胁迫,聚乙二醇(PEG)模拟干旱胁迫分别对‘日本晴’幼苗进行时间进程处理,表明OsGRP1基因表达受其诱导上调。为了进一步验证OsGRP1是否参与抗逆,我们又通过酶活性检测、遗传表型等分析方法,最终证明 OsGRP1 确实参与ABA诱导的抗氧化防护途径。

1 材料与方法

1.1 植物材料、菌株与载体

用于Co-IP试验的烟草为本生烟烟草,用于BiFC试验、RT-qPCR分析表达量等试验所需的水稻为野生型‘日本晴’,用于抗氧化防护及耐逆性分析所需的OsGRP1超表达材料由武汉天问生物科技有限公司构建,OsGRP1突变体材料由本实验室构建,以上植物材料均由本实验室保管。

大肠杆菌感受态细胞EscherichiacoliDH5α、原核表达蛋白菌株Rosetta(DE3)购于TaKaRa公司;农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株为GV3101购于南京沃华生物科技有限公司;酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株Y187 Yeast Strain、Y2H Gold Yeast Strain为实验室原有保存的菌株。pMD19-T载体购于TaKaRa公司;Y2H试验中的pGADT7、pGBKT7,GST pull-down试验中的pET30a、pGEX-4T-1,Co-IP试验中的pCMBIA1300-Flag、pCMBIA1300-Myc以及BiFC试验中的pSCYCE、pSCYNE等载体均由本实验室保存。

1.2 OsGRP1基因系统进化树分析

通过国家水稻数据中心查询OsGRP1基因的CDS序列和氨基酸序列,把OsGRP1编码的氨基酸序列与GenBank中其他植物的氨基酸序列比较并进行同源性分析。利用MEGA 5软件进行系统进化树分析。

1.3 Y2H、GST pull-down、Co-IP、BiFC验证互作

构建pGADT7-ZFP36和pGBKT7-OsGRP1融合质粒,用Y187 Yeast Strain和Y2H Gold Yeast Strain菌株制作感受态,通过PEG-LiAc转化体系,将质粒导入感受态内,涂布到缺色氨酸和亮氨酸(SD/-Trp/-Leu)的二缺培养基上,把长大的菌落用无菌水稀释,并滴在含有X-α-gal的缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/+X-α-gal)的四缺培养基上,培养2 d左右。

构建GST-OsGRP1和His-ZFP36重组质粒,通过原核表达体系表达重组蛋白和GST蛋白,在Pull-down结合缓冲液中,使试验组GST-OsGRP1蛋白与His-ZFP36蛋白以及对照组GST蛋白与His-ZFP36蛋白充分结合2 h,在缓冲液中结合后利用磁力架吸附GST标签蛋白,并用PBS清洗3次,在SDS-PAGE中分离蛋白,并用anti-His或者anti-GST单克隆抗体检测蛋白。

构建ZFP36-Flag和OsGRP1-Myc重组质粒,利用烟草真核表达体系,把质粒通过农杆菌GV3101介导侵染本生烟草,暗培养12 h,28 ℃光照培养2 d后,取叶片研磨提取蛋白,加入anti-Myc单克隆抗体及 protein A beads珠子进行免疫沉淀,在SDS-PAGE中分离蛋白,试验组用anti-Flag或者anti-Myc进行免疫印迹检测蛋白。

构建pSCYNE-OsGRP1和pSCYCE-ZFP36重组质粒进行BiFC试验,分离水稻原生质体,利用PEG-CaCl2体系将质粒转化进原生质体,26 ℃培养过夜,在激光共聚焦显微镜下检测荧光表达情况。

1.4 水稻幼苗期OsGRP1基因表达模式分析

在28 ℃、光照/黑暗时间16 h/8 h条件下培养野生型‘日本晴’水稻2周,用ABA、H2O2和H2O等按照时间梯度处理幼苗,分别取3株处理过的水稻幼苗,其中水处理为对照,用液氮在研钵中将整株幼苗研磨成白色粉末,用Trizol法提取植物总RNA,按照ABm公司的方案进行反转录,设计RT-qPCR引物,用翊圣公司的定量试剂预混样品,采用Bio-Rad定量PCR仪进行反应,以水稻β-actin作为内参,采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量,试验重复3次。

为了探究ABA是如何诱导OsGRP1基因的表达上调,将培养2周的水稻幼苗用ddH2O、H2O2清除剂二甲基硫脲(DMTU)和H2O2抑制剂二苯基氯化碘(DPI)预处理水稻幼苗4 h,再分别用ABA诱导20和240 min后取样,以同等条件下ddH2O处理为空白对照组。用上述方法提取水稻总RNA,反转录后用 RT-qPCR 进行OsGRP1基因表达量的分析,试验重复3次。

1.5 OsGRP1转基因水稻中OsGRP1基因表达量分析

将得到稳定遗传的OsGRP1转基因水稻幼苗移栽至大田,收获种子进行萌发,待其长到3叶期幼苗的时候,分别取3株幼苗提取RNA,再反转录为cDNA,通过RT-qPCR进行OsGRP1基因表达量的测定,使用GraphPad Prism 7软件进行数据及误差分析。

1.6 OsGRP1基因参与ABA调控的抗氧化防护过程分析

将OsGRP1超表达植株、突变体植株和野生型‘日本晴’培养至3叶期,置于ddH2O中培养4 h以上,使水稻内环境处于稳态,再用100 μmol·L-1ABA处理2 h,以同等条件下ddH2O处理的幼苗为对照组,试验组和对照组分别取20株进行处理。10株用于提取叶片RNA,再反转为cDNA,通过RT-qPCR测定其抗氧化防护酶基因OsCatB和OsSodCc2的表达量;另10株用于提取蛋白粗酶液,测定CAT和SOD活性,分析OsGRP1基因在水稻ABA诱导的抗氧化防护途径中的作用。在水稻数据库中找到基因OsGRP1、OsCatB和OsSodCc2的序列,用Primer Premier 5.0软件设计用于RT-qPCR的引物,引物序列见表1。

表1 本研究RT-qPCR所用的引物Table 1 The primers used for RT-qPCR in this study

1.7 OsGRP1基因在水稻干旱、氧化胁迫中的耐逆性分析

将OsGRP1超表达植株、突变体植株和野生型‘日本晴’培养至3叶期,分别用20% PEG 4000和100 mmol·L-1H2O2进行处理,其中OsGRP1-OE1、OsGRP1-OE2、OsGRP1-KO1和OsGRP1-KO2各18株(OE代表超表达植株,KO代表突变体植株),野生型(WT)有36株。处理15 d后,观察其生理表型并统计其存活率、株高、鲜重和根长。然后对其进行复水,复水14 d后,再次观察其生理表型,并统计其存活率、株高、鲜重和根长,试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 OsGRP1的系统进化树分析

OsGRP1基因的全长为642 bp,编码214个氨基酸,将OsGRP1编码的氨基酸序列与GenBank中其他植物的氨基酸序列比较并进行同源性分析。从图1可知:水稻OsGRP1与拟南芥中At3g20470、At5g07530、At4g36020和At4g368680等同源,且与At3g20470和At5g07530亲缘关系最近。

图1 水稻OsGRP1与其他物种同源蛋白的进化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of OsGRP1 in Oryza sativa and homologous proteins of other species括号内数值代表GRP家族中的分类。The number in parentheses indicate classification of GRP family.

2.2 OsGRP1与ZFP36互作真实性验证

从Y2H试验结果(图2-A)可知,在二缺酵母板上,所有酵母菌长势饱满,状态健康,说明酵母转化体系正常;在四缺酵母板上,阳性对照pGADT7-T+pGBKT7-53正常生长并且变蓝,阴性对照pGADT7-T+pGBKT7-Lam不生长也不变色,pGADT7-ZFP36+pGBKT7和pGBKT7-OsGRP1+pGADT7-T同样不生长也不变色,说明2个蛋白均不存在自激活现象,试验组pGADT7-ZFP36+pGBKT7-OsGRP1正常生长并变蓝。这说明OsGRP1与ZFP36在酵母菌内存在相互作用。

从GST pull-down试验结果(图2-B)可知,Input分析显示所有蛋白都正常表达,并在试验组GST-OsGRP1+His-ZFP36中,用anti-His单克隆抗体检测出有His-ZFP36的条带,说明GST-OsGRP1蛋白在体外把His-ZFP36蛋白“拉住”,这说明OsGRP1与ZFP36在体外存在相互作用。

从Co-IP试验结果(图2-C)可知,Input分析显示所有蛋白都正常表达,并在试验组ZFP36-Flag+OsGRP1-Myc中,用anti-Flag单克隆抗体检测出ZFP36-Flag的条带,说明OsGRP1与ZFP36在烟草体内存在相互作用。

从BiFC试验结果(图2-D)可知,通过激光共聚焦显微镜观察发现,在对照组pSCYNE-OsGRP1+pSCYCE和pSCYCE-ZFP36+pSCYNE没有观察到荧光,说明其没有合成YFP完整蛋白,试验组pSCYNE-OsGRP1+pSCYCE-ZFP36在YFP激发光下细胞核发出黄色荧光,说明OsGRP1与ZFP36互作,YFP在细胞核中完整组合并成功表达YFP蛋白。这说明OsGRP1与ZFP36在原生质体内存在相互作用,并初步判断两者共定位于细胞核中。

图2 OsGRP1和ZFP36相互作用真实性的验证Fig.2 Verification of the authenticity of the interaction between OsGRP1 and ZFP36A. 酵母双杂交验证OsGPR1与ZFP36互作;B. GST pull-down验证OsGPR1与ZFP36互作;C. Co-IP验证OsGPR1与ZFP36互作;D.BiFC验证OsGPR1与ZFP36互作。A. Yeast two-hybrid verifies the interaction between OsGPR1 and ZFP36;B. GST pull-down verifies the interaction between OsGPR1 and ZFP36;C. Co-IP verifies the interaction between OsGPR1 and ZFP36;D. BiFC verifies the interaction between OsGPR1 and ZFP36.

2.3 水稻幼苗期OsGRP1基因表达模式分析

用ABA处理野生型‘日本晴’水稻幼苗,与对照相比,OsGRP1基因表达量分别在20和240 min极显著上升,在20和240 min出现峰值(图3-A);不同时间H2O2处理野生型‘日本晴’水稻幼苗,与对照相比,OsGRP1基因表达量分别在10和90 min极显著上升,在10和360 min出现峰值(图3-B)。用NaCl模拟离子胁迫,用PEG模拟干旱胁迫分别对野生型‘日本晴’水稻幼苗进行不同时间处理。与对照相比,OsGRP1基因表达量分别在45和180 min极显著上升,在45和180 min出现峰值(图3-C);与对照相比,OsGRP1基因表达量在60和240 min极显著上升,在60和240 min出现峰值(图3-D)。以上结果证明OsGRP1基因的表达受ABA、H2O2、NaCl和PEG诱导上调。

在没有外源ABA诱导的情况下OsGRP1的表达不会受到二甲基硫脲(DMTU)和二苯基氯化碘(DPI)影响;对照组在ABA诱导后,OsGRP1基因的表达量显著上升,而经DMTU和DPI预处理后的样品经ABA诱导后,OsGRP1基因的表达量并无明显上升(图3-E)。这证明ABA是通过诱导产生内源H2O2来实现诱导OsGRP1基因的表达上调。

图3 水稻幼苗期OsGRP1基因表达量分析Fig.3 Analysis of OsGRP1 gene expression level in rice seedlingsA—D. ABA、H2O2、NaCl和PEG处理对水稻中OsGRP1基因表达的影响;E. DMTU、DPI处理后,再用ABA处理对OsGRP1基因表达的影响。CK:不作预处理;DMTU:H2O2清除剂二甲基硫脲(DMTU)预处理水稻幼苗4 h;DPI:H2O2抑制剂二苯基氯化碘(DPI)预处理水稻幼苗4 h。 *P<0.05,**P<0.01。下同。A-D. The effects of ABA,H2O2,NaCl and PEG treatment on the expression of OsGRP1 gene in rice;E. The effect of DMTU and DPI treatment and then treatment with ABA on the expression of OsGRP1 gene. CK:No pretreatment;DMTU:H2O2 scavenger dimethylthiourea(DMTU)pretreatment of rice seedlings for 4 h;DPI:H2O2 inhibitor diphenyl iodide chloride(DPI)pretreatment of rice seedlings for 4 h. *P<0.05,**P<0.01. The same as follows.

2.4 OsGRP1转基因水稻中OsGRP1基因的表达

从图4可见:超表达水稻中OsGRP1-OE1和OsGRP1-OE2的OsGRP1基因表达量极显著高于野生型WT,OsGRP1-OE1水稻中OsGRP1基因表达量约是对照组的6倍,OsGRP1-OE2水稻中OsGRP1基因表达量是对照组的5倍多。在突变体水稻中OsGRP1-KO1和OsGRP1-KO2的OsGRP1基因表达量极显著低于WT,与对照组相比,OsGRP1基因基本不表达,说明OsGRP1-KO1和OsGRP1-KO2水稻中OsGRP1基因被敲除。

图4 RT-qPCR分析OsGRP1转基因水稻中OsGRP1基因的表达Fig.4 RT-qPCR analysis of OsGRP1 gene expression in OsGRP1 transgenic riceWT:野生型水稻Wild-type rice;OsGRP1-OE1/OE2:OsGRP1基因超表达水稻2个株系Two strains of rice overexpressing OsGRP1 gene;OsGRP1-KO1/KO2:OsGRP1基因突变体水稻2个株系Two strains of rice mutant of OsGRP1 gene.

2.5 OsGRP1参与ABA调控的抗氧化防护过程

植物的抗氧化防护是其体内各种相关酶协同作用的结果,包括CAT和SOD等,通过RT-qPCR技术,测定在OsGRP1转基因材料中抗氧化防护酶基因OsCatB和OsSodCc2的转录情况,以‘日本晴’作为对照。从图5-A可见:OsCatB和OsSodCc2转录水平受ABA调控,在OsGRP1-OE1和OsGRP1-OE2水稻中,OsCatB和OsSodCc2基因的表达量高于野生型(WT),ABA处理组OsCatB和OsSodCc2基因的表达量显著高于对照组;在OsGRP1-KO1和OsGRP1-KO2水稻中,OsCatB和OsSodCc2基因的表达量低于WT,ABA处理组OsCatB和OsSodCc2基因的表达量高于对照组,可以证明OsGRP1参与ABA途径的抗氧化防护酶基因表达的调控。

从图5-B可见:CAT和SOD活性的变化趋势与图5-A中类似,在OsGRP1-OE1和OsGRP1-OE2水稻中,CAT和SOD活性高于WT,ABA处理组CAT和SOD活性显著高于对照组;在OsGRP1-KO1和OsGRP1-KO2水稻中,CAT和SOD活性低于WT,ABA处理组CAT和SOD活性高于对照组,但不能恢复到与WT同等活性,证明OsGRP1参与ABA途径的抗氧化防护酶活性的调控。上述结果证明 OsGRP1参与ABA调控的抗氧化防护过程。

图5 OsGRP1参与ABA调控的抗氧化防护分析Fig.5 Antioxidant protection analysis of OsGRP1 involved in ABA regulationA、B. OsGRP1基因调控抗氧化防护酶基因OsCatB和OsSodCc2的表达;C、D. OsGRP1基因调控抗氧化防护酶CAT和SOD的活性。A,B. OsGRP1 gene regulates the expression of antioxidant protection enzyme genes OsCatB and OsSodCc2;C,D. OsGRP1 gene regulates the activities of antioxidant protection enzymes CAT and SOD.

2.6 OsGRP1基因对水稻干旱胁迫和氧化胁迫的影响

从图6可见:在对照组,不同材料在株高、鲜重和根长方面表现无显著差异,在20% PEG 4000模拟干旱胁迫和100 mmol·L-1H2O2模拟氧化胁迫处理组,OsGRP1-OE1和OsGRP1-OE2幼苗株高、根长以及存活率都显著高于WT幼苗;OsGRP1-KO1和OsGRP1-KO2水稻幼苗株高、根长以及存活率都显著低于WT。证明超表达OsGRP1基因增强了水稻对干旱胁迫和氧化胁迫的耐受性。

图6 OsGRP1转基因水稻对干旱胁迫和氧化胁迫的耐受性分析Fig.6 Tolerance analysis of OsGRP1 transgenic rice to drought stress and oxidative stressA. 20% PEG 4000模拟干旱胁迫条件下的水稻表型;B. 100 mmol·L-1 H2O2模拟氧化胁迫条件下的水稻表型;C. 在干旱和氧化胁迫下水稻存活率、株高、鲜重和根长。A. Phenotype of rice under 20% PEG 4000 simulated drought stress conditions;B. Phenotype of rice under simulated oxidative stress conditions with 100 mmol·L-1 H2O2;C. Under drought and oxidative stress,the statistics of rice survival rate,plant height,fresh weight and root length.

3 讨论

植物在生长发育过程中会不断受到生物和非生物逆境胁迫,影响其正常生长发育,在长期的进化过程中,植物演变出多种防护体系抵御外界的伤害,其中ABA所介导的抗氧化防护途径尤为重要。当植物遭遇干旱、盐等非生物胁迫时,体内会迅速积累ABA,所积累的ABA作为信号分子,能增加植物体内活性氧(ROS)的产生,同时上调抗氧化防护系统的活性,增强植物对干旱胁迫的耐性。在ABA信号途径中Ca2+、ROS信号彼此交叉联系起作用,植物中ABA与其受体结合后,依靠胞内多种传递信号分子(Ca2+、ROS等)将信号向下游传递,其中ROS作为胞内的第二信使(以H2O2最为典型)受ABA诱导后,会激活质膜上Ca2+通道进而调节气孔关闭;另外ABA又通过诱导抗氧化防护酶CAT、SOD、APX活性增加和GR基因表达来消除ROS对细胞产生的氧化损伤[24-27]。

研究表明,许多转录因子与ABA参与的逆境胁迫响应有关。拟南芥中与逆境相关的锌指蛋白基因AtSAP5主要在根中表达并受高盐、干旱和低温的诱导,无论在拟南芥正常生长条件还是干旱胁迫下AtSAP5的过量表达能够促进其他干旱逆境相关基因的表达,并增强转基因植株的耐旱性,且AtSAP5具有E3泛素连接酶活性,是一种逆境响应的正调节物。实验室前期研究证明水稻锌指蛋白ZFP36作为一种锌指型转录因子,参与ABA诱导的抗氧化防护途径,并且ZFP36能够正向调控抗氧化酶(CAT、SOD、APX)活性和其相关基因的表达,从而提高水稻对干旱胁迫和氧化胁迫的耐受性[28]。

本研究中,水稻OsGRP1作为非典型的甘氨酸富集基因,经过遗传进化分析,其与拟南芥中At3g20470和At5g07530基因同源,而这2个基因分属Ⅰ类和Ⅲ类甘氨酸富集基因,又因为OsGRP1是由酵母双杂交筛库得到的转录因子ZFP36的互作因子,而ZFP36在ABA调控的抗氧化防护途径中具有重要作用,因此OsGRP1也可能在植物抗逆的生理过程中发挥重要作用。

本研究通过Y2H、GST Pull-down、Co-IP以及BiFC试验证明OsGRP1与ZFP36真实互作,再通过ABA、H2O2、NaCl、PEG试验得知OsGRP1基因的表达受其诱导上调,经过DMTU、DPI处理后分析得知ABA是通过内源H2O2调节OsGRP1基因的表达。以上结果说明,OsGRP1基因响应ABA调节过程需要H2O2参与。经过RT-qPCR分析可知,水稻中超表达OsGRP1基因,导致氧化胁迫酶CAT和SOD活性增加,OsCatB和OsSodCc2基因表达量上升,而在水稻中敲除OsGRP1基因则会导致表达量下降,且在敲除材料中用ABA处理也不能明显恢复其表达量,证明OsGRP1参与ABA调控的抗氧化防护过程。对OsGRP1转基因水稻进行耐逆性分析,证明超表达OsGRP1基因增强了水稻对干旱胁迫和氧化胁迫耐受性。

综上所述,本研究通过酵母双杂交试验筛选出OsGRP1是ZFP36的互作蛋白,验证OsGRP1参与ABA诱导的抗氧化防护途径并验证超表达OsGRP1基因能提高水稻在耐旱和抗氧化胁迫中的耐性,对探索水稻OsGRP1基因参与调控植物生长发育以及逆境胁迫信号转导机制的调控作用具有重要意义。