辣椒胶孢炭疽菌CFEM效应因子鉴定及转录组分析

刘思珍,欧阳超,满益龙,盛家伟,陈岳,张鑫,郑立敏,李智强,李大伟,张德咏,刘勇,王运生,谭新球*

(1.湖南大学研究生院隆平分院,湖南 长沙 410125;2.湖南省农业科学院植物保护研究所,湖南 长沙 410125;3.湖南省农业科学院生物技术研究所,湖南 长沙 410125;4.湖南农业大学植物保护学院,湖南 长沙 410128;5.中国农业科学院植物保护研究所,北京 100193;6.西北农林科技大学园艺学院,陕西 杨凌 712100)

辣椒是我国第二大蔬菜作物,长期受炭疽病危害[1],其致病菌主要危害辣椒茎、叶和果实,导致辣椒产量损失严重,品质急剧下降,造成巨大的经济损失。目前辣椒炭疽病的防治采取以种植抗性品种为核心,以化学农药防治为主的防治措施,但是由于病原菌种群遗传变异复杂,导致品种抗性丧失、病原菌抗药性产生等问题,使得辣椒产区炭疽病频发,防治困难。因此亟需明确病原菌与辣椒互作机制,为新型防控技术的研发提供理论依据。

近年来,效应因子一直是病原真菌与寄主植物互作的研究热点。真菌效应因子在病原真菌和寄主的互作中发挥着至关重要的作用,直接影响病原真菌的侵入、扩展和病害发生[2-4]。常见真菌细胞外膜蛋白(common in several fungal extracellular membrane proteins,CFEM),约编码60个氨基酸,具有特征性的8个半胱氨酸残基[5]。CFEM效应因子已被证实与病原菌的致病力[6]、细胞壁稳定性[7-8]和致病过程密切相关[5,9-10]。如稻瘟菌(Magnaportheoryzae)中,Pth11、ACI1及MoCDIP2 这3个CFEM蛋白均在附着胞形成期上调表达[5,11-13],其中Pth11作为G蛋白偶联受体,含有7个跨膜区域和1个CFEM,是附着胞形成的必需蛋白[14-15]。CFEM效应因子也调控白色念珠菌(Candidaalbicans)菌丝生长及其致病性[16-17]。同时,研究也发现CFEM的结构域长度相对保守,但是不同真菌之间的结构域数目差异很大[18-19],暗示CFEM效应因子生物学功能的多样化。

CFEM效应因子预测与分析可为后期病原菌与寄主互作、致病机制等研究提供重要信息。目前研究已发现稻瘟菌约含61个CFEM 蛋白[20];禾谷胶孢炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)约含32个CFEM效应因子[21];草莓胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioide)约含22个CFEM效应因子[22],表明不同病原菌中的CFEM效应因子存在数量差异。相关研究表明,CFEM效应因子在病原菌侵染寄主植物过程中发挥作用。如禾谷胶孢炭疽菌有22个CFEM效应因子具有信号肽,均在病原菌的侵染阶段表达,其中有3个CFEM效应因子在病原菌活体寄生阶段和死体寄生阶段均有表达,可能与病原菌致病性关系更为密切[21];草莓胶孢炭疽菌有8个CFEM效应因子均在侵染阶段表达,其中CGGC5-13478.1在整个侵染阶段表达量上调大于80倍,可能参与整个胶孢炭疽菌侵染植物的整个过程[22]。

辣椒胶孢炭疽菌是辣椒炭疽病的优势种群,在我国主要辣椒产区均有发生和危害。目前未见其CFEM 效应因子的相关报道。因此,该研究基于辣椒胶孢炭疽菌CSLL-11的基因组测序结果,参照NCBI网站(http://www.ncbi.nlm nih.gov/)公布的玉米炭疽菌基因组数据和注释信息,采用生物信息学手段,从全基因组水平上分析鉴定辣椒胶孢炭疽菌的CFEM效应因子的组成和结构特征,利用转录组数据初步分析CFEM效应因子的表达模式差异,同时根据表达模式,选择其中的5个CFEM效应因子进行亚细胞定位分析。研究结果为进一步探究CFEM效应因子的生物学功能奠定基础,对揭示辣椒胶孢炭疽菌致病机制具有重要的科学意义,同时也可为研发辣椒炭疽病新的防治靶标提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及供试材料

辣椒胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)野生型菌株CSLL-11经单孢分离、病原鉴定后保存备用;PBin-GFP载体为湖南省农业科学院植物保护研究所真菌实验室(本实验室)保存;农杆菌GV3101感受态为本实验室制备;试验所用的辣椒品种为抗性品种‘TC9612’和感病品种‘湘研15号’;试验所用的模式植物为本氏烟;大肠杆菌感受态DH5α购自北京全式金公司。

1.2 培养基

PDA培养基:购自索莱宝公司制备的不含抗生素的马铃薯葡萄糖培养基,取46 g该培养基于1 L ddH2O溶解,121 ℃高压灭菌20 min。主要用于辣椒胶孢炭疽菌的培养。

液体PDA培养基:称取去皮土豆200 g,加入适量的ddH2O在电磁炉上加热至沸腾,维持20～30 min,用2层纱布趁热在量杯上过滤,弃去滤渣;在滤液中加入葡萄糖20 g,玻璃棒搅拌溶解后,ddH2O定容至 1 000 mL,121 ℃高压灭菌20 min。

LB培养基:包含液体LB培养基和固体LB培养基,胰蛋白胨10 g·L-1,酵母提取物5 g·L-1,氯化钠 10 g·L-1,加ddH2O定容至1 L,pH值调节至7.0,121 ℃高压灭菌 20 min;固体培养基在液体培养基基础上加琼脂。主要用于大肠杆菌培养及农杆菌培养。

1.3 试剂

RNA反转录试剂盒[Hiscript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)]购自诺唯赞公司;RNA提取试剂盒(TransZol UP Plus RNA Kit)、大肠杆菌感受态试剂盒(pEasy-Blunt Cloning Kit)均购自北京全式金公司;限制性内切酶购自NEB公司;DNA聚合酶及三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、缓冲液(buffer)、T4DNA 连接酶均购自TaKaRa公司;质粒提取试剂盒购自天根公司;各种抗生素(潮霉素、卡那霉素、氨苄霉素、利福平)购自Roche公司,潮霉素、卡那霉素、氨苄霉素均配制成50 mg·mL-1储藏液,利福平配制成 25 mg·mL-1储藏液,-20 ℃贮存备用。

1.4 试剂制备

乙酰丁香酮(AS)母液:用二甲亚砜配成1 mol·L-1溶液,细菌过滤器过滤后,-20 ℃保存;MgCl2母液:用无菌水配成1 mol·L-1溶液,细菌过滤器过滤后,4 ℃保存;2-吗啉乙磺酸(MES)母液:用无菌水配成 500 mmol·L-1溶液,用NaOH调pH值至5.6,细菌过滤器过滤后,4 ℃保存。使用时,将母液稀释到工作浓度:MES 20 mmol·L-1,AS 10 μmol·L-1,MgCl210 mmol·L-1,混合后使用。

1.5 生物学信息分析

参照NCBI(http://www.ncbi.nlm nih.gov/)玉米炭疽菌全基因组数据库,通过用 SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测蛋白质氨基酸的N端信号,按要求输入30个氨基酸序列的Fasta格式,N端信号肽分析选择默认设置。利用在线工具TMHMM2.0 Server(http://www. cbs. dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测其跨膜结构域结果。通过TargetP 1.1 Server(http//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)对辣椒胶孢炭疽菌CFEM效应因子的亚细胞定位进行预测。

1.6 总RNA提取与纯化

取生长健康、大小一致的不同品种(抗性品种‘TC9612’和感病品种‘湘研15号’)辣椒红果进行人工接种。试验设置处理组和对照组,每组接种15个辣椒果实,设4次重复。处理组:制备C.gloeosporioidesCSLL-11的分生孢子悬浮液5×105mL-1,采用针刺人工接种方法分别接种到感病品种‘湘研15号’和抗性品种‘TC9612’的果实上部、中部和下部。对照组采用无菌水接种。根据辣椒胶孢炭疽菌附着胞形成阶段(appressoria phase)、活体营养阶段(biotrophic phase)和死体营养阶段(necrotrophic phase)3个阶段特征,于接种后12、36和96 h分别取对照组及处理组辣椒果实的接种区域,按照TransZol UP Plus RNA Kit使用说明分别提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度计检测总RNA的质量和浓度,检测合格的样品送上海欧易生物医学科技有限公司进行转录组测序。

1.7 辣椒胶孢炭疽菌CSLL-11部分 CFEM 效应因子的亚细胞定位验证

1.7.1 辣椒胶孢炭疽菌CSLL-11 mRNA提取和目标CFEM效应因子cDNA制备取固体培养基上培养的辣椒胶孢炭疽菌CSLL-11菌落,切成小块于液体PDA培养基,200 r·min-1摇床培养48 h;用滤膜过滤,收获菌丝,用无菌水将菌丝冲洗2～3次,以去除培养基残渣;用无菌滤纸移除菌丝表面多余水分,将菌丝放入液氮预冷的研钵中,研棒充分研磨后取适量置于2 mL离心管中,按照TransZol UP Plus RNA Kit使用说明提取纯化mRNA,分管贮存至-80 ℃备用。cDNA的制备:采用Hiscript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper),按照说明书将mRNA反转录为cDNA,分管贮存至-20 ℃备用。

1.7.2 目标CFEM效应因子的克隆与分析以1.7.1节制备的cDNA为模板,克隆5个CFEM效应因子,对应的引物如表1。PCR体系采用TaKaRa TaqTM体系,扩增体系和反应程序均参照说明书。PCR产物用TaKaRa纯化回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0)回收。连接、转化按pEasy-Blunt Cloning Kit说明书进行操作。菌落PCR筛选鉴定阳性克隆转化子,并送至上海生物工程股份有限公司武汉分公司测序。利用DNAMAN 7.0对测序结果与基因组序列进行比对分析,提取阳性克隆的质粒进行下一步试验。

1.7.3 CFEM效应因子亚细胞定位载体的构建根据表1中相应CFEM效应因子克隆引物,以1.7.2节相应阳性转子的质粒为模板(1∶50稀释),PCR扩增出相应CFEM效应因子DNA片段,采用DpnⅠ消化移除多余的质粒模板,利用TaKaRa纯化回收试剂盒回收PCR产物。5个CFEM效应因子和PBin-GFP按照表1相对应的酶进行酶切,酶切体系参照NEB公司的说明书。酶切完成后纯化回收获得CFEM效应因子的克隆目标片段和目标载体。将目标片段和目标载体使用TaKaRa T4连接酶进行连接,具体操作参照Li等[23]的连接方法,然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,转化步骤按照pEasy-Blunt Cloning Kit操作说明进行。菌落PCR筛选鉴定阳性克隆子,获得重组载体PBin-GFP-CghnCFEM13471、PBin-GFP-CghnCFEM13279、PBin-GFP-CghnCFEM02929、PBin-GFP-CghnCFEM09727和PBin-GFP-CghnCFEM14146。菌落PCR筛选鉴定阳性克隆转化子,提取阳性克隆质粒并进行下一步试验。

表1 5个CFEM效应因子引物序列Table 1 Primers used to clone five CFEM effectors in Colletotrichum gloeosporioides

1.7.4 农杆菌电击转化将1.7.3节构建完成的PBin-GFP-CghnCFEM效应因子质粒通过电击法转至农杆菌GV3101,具体步骤参照张云峰等[24]农杆菌电击转化方法进行。电击完成后,28 ℃、200 r·min-1培养1 h,取100 μL菌悬液涂布在含有25 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素的抗性LB培养基上,28 ℃黑暗培养48 h。挑取农杆菌菌落,经特异性PCR引物验证后,阳性转化子于LB液体培养基(含25 mg·L-1利福平+50 mg·L-1卡那霉素),28 ℃、200 r·min-1培养48 h,保存菌液。

1.7.5 重组载体在本氏烟上的瞬时表达与分析将1.7.4节获得的阳性农杆菌转化子扩繁后,当D600=1.0时,5 000 r·min-1离心弃去LB培养基,悬浮菌体,调节菌体悬浮液浓度到D600值为0.5左右,菌体悬浮液室温静置3 h;选取3～4周龄烟草叶片,采用10 mL的注射器,去除针头,具体参照黎茵等[25]的农杆菌注射渗透法,将悬浮液压入烟草叶片细胞,并做好标记,经注射的烟草植株在25 ℃、光/暗时间为14 h/10 h 的光周期下培养2 d。取样制作玻片,激光共聚焦显微镜(尼康c2 plus)下观察CFEM效应因子亚细胞定位情况。以空载体PBin-GFP、核定位载体PBin-GFP:CoNIS1[26]、清水处理作为对照。观察时,拍照记录定位情况。

2 结果与分析

2.1 辣椒胶孢炭疽菌CFEM效应蛋白信号肽分析

信号肽是真菌分泌蛋白的基本特征。本研究利用SignalP 4.1 Server在线分析辣椒胶孢炭疽菌CSLL-11的基因组,结果表明:辣椒胶孢炭疽菌CSLL-11含有30个CFEM效应因子,其中26个CFEM效应因子 N端氨基酸序列具有典型的信号肽,均位于N端16～30个氨基酸(表2)。

2.2 辣椒胶孢炭疽菌CFEM效应因子跨膜结构域预测

利用TMHMM2.0 Server软件分析,发现30个CFEM效应因子中13个不含跨膜结构域,17个含有数目不等的跨膜结构域,其中 CFEM效应因子Cghn00284的跨膜结构域最多,为19个;CFEM效应因子Cghn13741和Cghn05690的跨膜结构域最少,为6个(表2)。

2.3 辣椒胶孢炭疽菌CFEM效应因子的亚细胞定位预测分析

利用TargetP 1.1 Server对26个具有信号肽的CFEM效应因子进行亚细胞定位预测分析,结果表明:26个CFEM效应因子均通过分泌途径分泌至胞外。定位可信度分析显示:除Cghn03726、Cghn07893、Cghn09289、Cghn10687和Cghn10927 这5个效应因子定位可信度略低外(Pr<0.6),其余15个CFEM效应因子的定位预测可信度皆较高(Pr>0.6)。26个CFEM效应因子均具有信号肽,且所有分泌蛋白SP的得分值≥0.755,可能通过分泌途径分泌至胞外(表2)。

表2 辣椒胶孢炭疽菌CFEM效应因子结构分析Table 2 Analysis of CFEM effect factor structure in C.gloeosporioides from pepper plants

2.4 辣椒胶孢炭疽菌CFEM效应因子的转录分析

对辣椒胶孢炭疽菌CFEM效应因子的转录组进行分析,结果如图1所示。CFEM效应因子Cghn01651、Cghn07586、Cghn10235、Cghn12664、Cghn13471和Cghn14998在其侵染辣椒果实各阶段的表达量均很低,推测这些效应因子可能在侵染与致病过程中作用不明显。CFEM效应因子Cghn02929、Cghn09727、Cghn12645和Cghn14146在侵染辣椒果实各个阶段表达均较高,推测可能参与病菌的整个致病过程。CFEM效应因子Cghn07893在侵染过程中转录水平整体下降,并有先降后升的趋势,推测该效应因子在病原菌侵染过程中存在功能分化的可能。CFEM效应因子Cghn06262、Cghn09571和Cghn13279在侵染的中后期表达量均较高,推测可能与菌丝的侵染扩展相关。

图1 CFEM效应因子转录组分析

2.5 辣椒胶孢炭疽菌部分CFEM效应因子的亚细胞定位

根据CFEM效应因子在侵染辣椒果实不同阶段中的转录组分析结果,选择参与整个致病侵染过程的4个表达量较高的CFEM效应因子(Cghn14146、Cghn09727、Cghn13279和Cghn02929)以及在整个侵染过程中表达量较低的Cghn13471在模式植物本氏烟中进行亚细胞定位验证。结果(图2)表明:Cghn14146、Cghn09727和Cghn13279均定位于细胞膜和细胞质;Cghn02929、Cghn13471定位于细胞核、细胞膜和细胞质上。但Cghn13471在细胞膜上的定位不是连续的,在胞间连丝也有定位。

图2 5个CFEM效应因子亚细胞定位Fig.2 Subcellular location of five CFEM effectors from C.gloeosporioidesPBin-GFP:空载体,阴性对照;CoNIS1:阳性对照。PBin-GFP:Recombinant vector,control;CoNIS1:Positive control.

3 讨论

国内外研究表明,效应蛋白在植物病原真菌与寄主植物互作过程中发挥重要作用,主要涉及病菌生长发育和侵染等生理过程[27-28]。胶孢炭疽菌导致的辣椒炭疽病是辣椒生产上重要的真菌病害。基于辣椒胶孢炭疽菌基因组分析,发现该菌含有30个CFEM效应因子,效应因子数量介于禾谷胶孢炭疽菌(32个)[21]和草莓胶孢炭疽菌(22个)[22]之间;辣椒胶孢炭疽菌、禾谷胶孢炭疽菌和草莓胶孢炭疽菌三者具有信号肽、可分泌至胞外的CFEM效应因子数分别为13、22和8个。利用辣椒胶孢炭疽菌CSLL-11CFEM效应因子作参照,发现与草莓胶孢炭疽菌、禾谷胶孢炭疽菌和橡胶胶孢炭疽菌(Cg-14)具有同源性的CFEM分别为15、10和23个,仅Cghn05708、Cghn07586、Cghn09727、Cghn10927、Cghn13471、Cghn14998和Cghn12645这7个CFEM效应因子在不同寄主来源的胶孢炭疽菌间高度保守,表明病原菌与寄主互作过程CFEM效应因子存在进化差异。

前期研究证实稻瘟菌中Pth11基因的敲除削弱了病原菌在植物表面形成附着胞的能力,并显著降低了稻瘟菌的致病性[29];橡胶胶孢炭疽菌CgCFEM3基因编码1个胞外分泌效应蛋白,参与调控胶孢炭疽菌菌丝和分生孢子产量以及致病过程[30];烟曲霉(Aspergillusfumigatus)中CFEM蛋白参与细胞壁稳定,但不参与血红素摄取或生物膜形成[8];白色念珠菌中含 CFEM 结构域的CAS1与致病性相关[31]。另外,在白色念珠菌中,3个CFEM细胞壁蛋白(Rbt5、Pga7和Csa1)与生物膜形成和与血红素中获取铁有关[31];在近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)中3个CFEM效应因子(CFEM2、CFEM3和CFEM6)都参与了从血红素获得铁的过程,但敲除这3个效应因子对近平滑假丝酵母生物膜形成无影响[31]。表明不同物种的CFEM效应因子间存在差异,执行着不同的功能。我们前期研究发现,不同区域来源的辣椒胶孢炭疽菌在相同品种辣椒和模式植物本氏烟上表现出明显致病性差异(病斑大小相差0.5～1.2 cm),病原菌菌丝生长速率(相差2～2.5倍)、产孢量(相差20～320倍)和分生孢子大小差异明显(数据正在投稿中),而且本研究结果发现30个效应因子在侵染和致病过程中表达量存在差异,因此推测CFEM效应因子在种群内可能存在功能性分化,这有待进一步验证。

本研究结合人工接种抗性品种‘TC9612’和感病品种‘湘研15号’的转录组数据,发现CFEM效应因子在病原菌侵染寄主过程中表达量存在明显差异。有14个CFEM效应因子特别是Cghn01651、Cghn07586、Cghn10235和Cghn12664在菌丝体的表达量很低或者检测不到,但是分生孢子阶段Cghn01651和Cghn12664表达量明显高于侵染阶段,推测这些效应因子在病菌侵染早期就分泌到胞外,并可能在附着胞形成初期发挥识别寄主的作用。另外有8个效应因子特别是Cghn02929、Cghn07893、Cghn09727和Cghn12645从接种到形成坏死过程中维持较高表达量,表明这8个效应因子可能在病原菌进入寄主植物细胞内时,干扰寄主相应受体靶标的识别过程,从而在寄主免疫防卫过程中发挥作用。根据转录组和不同表达的CFEM效应因子亚细胞定位分析发现,并不是所有的CFEM效应因子只定位在细胞膜上,在细胞核、细胞质和胞间连丝均有定位信号,可能与不同效应因子的跨膜结构域存在关联,反映了不同的CFEM效应因子执行不同的生物学功能。

综上所述,本研究以辣椒胶孢炭疽菌CSLL-11为例,利用其基因组数据和转录组数据,开展辣椒胶孢炭疽菌CFEM效应因子功能研究,有助于解析炭疽病病原菌-寄主辣椒互作与识别机制,为其抗性育种提供科学支撑。