CRISPR技术的简介及应用

章建瀛 王清水 钟雯婷 林幼玉

【摘要】基因组编辑技术是帮助治疗方法最具挑战性但最有效的工具之一。Crispr可以提高基因编辑的效率，并尽量减少脱靶率。定期排列的短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白（Cas9）是一种革命性的基因组编辑技术。CRISPR/Cas9在多种疾病中的新应用已经证明了它的有效性，并已应用于体外体细胞和多能干细胞的模型，以及体内动物模型，最终可能被用来纠正有缺陷的基因。本综述的重点是CRISPR/Cas9的最近应用及其对治疗具有挑战性的人类疾病的贡献，例如各种类型的癌症、神经退行性疾病和广泛的其他疾病。CRISPR技术是一种新的疾病治疗方法，提高了药物的有效性，促进了个性化医学的发展。

【关键词】CRISPR，Cas9，基因编辑，基因治疗，人类疾病

【中图分类号】R-3 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2021）08-104-03

English abstract：Genome editing techniques are considered to be one of the most challenging yet efficient tools for assisting therapeutic approaches. Several studies have focused on the development of novel methods to improve the efficiency of gene editing，as well as minimise their off-target effects.The focus of the present review was the recent applications of CRISPR/Cas9 and its contribution to the treatment of challenging human diseases，such as various types of cancer，neurodegenerative diseases and a broad spectrum of other disorders. CRISPR technology is a novel method for disease treatment，enhancing the effectiveness of drugs and improving the development of personalised medicine.

Keywords：CRISPR，cas9，gene editing，gene therapy，human diseases

細菌和古细菌在长期演化过程中，形成的一种获得性免疫防御体系，即CRISPR/Cas9，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。crRNA与 tracrRNA可以通过碱基配对形成复合体，这种复合体可以介导核酸内切酶酶 Cas9蛋白在特定位点剪切双链DNA，而人为去设计这两种RNA可以介导对 DNA 双链进行定点切割、DNA 序列的敲除、插入、定点突变以及组合编辑[1]。

II型CRISPR-Cas系统相比于I型和III型，结构比较简单，执行生物功能的部分仅由Cas9和tracrRNA：crRNA两个部分组成，而且操作更加简便。之前的研究曾将tracrRNA和crRNA分别表达形成双引导RNA系统，但这种系统容易引起非同源重组介导插入缺失的错误修复，但后来发现将crRNA与tracrRNA编辑合成单一的RNA嵌合体，也可以指导Cas进行切割[2]。通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合后的RNA具有与crRNA：tracrRNA复合体类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。

质粒等载体通过tracrRNA：crRNA介导Cas9切割的位点是有特异性的，即PAM序列上游的三个碱基对处。PAM仅有几个碱基构成（通常为NGG），它可以根据CRISPR/Cas系统的类型定位并精确排序[2]。PAM 序列是Cas9识别靶DNA的重要影响因素。目前研究表明，II型CRISPR特异性靶位点必须完美结合PAM序列和在gRNA3’末端的seed sequence 8-12个碱基[1]。

由于编辑基因效率高、设计操作简单与在多种细胞中通用性好等优势，CRISPR-Cas9 的基因组编辑技术成为ZFNs 与TALENs 之后的新一代基因组编辑技术。为了测CRISPR-Cas9系统HR（同源重组）的效率，研究者设计两种gRNA（T1和T2）作用于AAVS1片段，并且与之前了解到的TALEN技术进行活性比较。图中，通过流式细胞技术明显可以看出donor+ hCas9+T1 gRNA组、donor+hCas9+T2gRNA组比donor+AAV51 TALENs组的同源重组率要高得多[1]。ZFNs技术和TALENs都是之前已知已应用于基因组编辑人工核酸内切酶的方法，这两种方法只能在DNA的单链形成缺口，有一定的技术局限，而且成本较高，而CRISPR/Cas9酶可以在可以在DNA双链上形成缺口，操作比较简单并且效果显著。

CRISPR的II型系统内，为了识别并在目标DNA上形成双链切口，有几个结构是很重要的，一是crRNA与tracrRNA这两种RNA组成的dual-RNA结构或类似结构（sgRNA），二是Cas9内切酶，三是特定的位点即PAM序列。编辑好的Cas9内切酶与设计成一个单一转录因子的gRNA相互配合，可以标记并切割DNA序列。CRISPR-Cas9为基因靶标和基因编辑应用提供了更多可能性[2]。

CRISPR/Cas9技术的应用

一、在人类细胞基因水平上CRISPR-Cas9基因敲出、筛选。

通过编辑CRISPR关联的内切酶Cas9去修改特定的基因底座是一种新方法，这种方法可以更简单地了解基因的在全基因组水平上的功能。基因水平上CRISPR-Cas9 基因敲除庫已经标记了18080个基因和64751个独特的引导序列可以用于在人类细胞中的阴性筛选和阳性筛选。首先，在癌细胞和多能干细胞中使用GeCKO（genome-scale CRISPR-Cas9 knockout）库识别细胞存活必要基因，接着，在黑色素瘤模型中筛选缺失vemurafenib抑制剂的基因。研究者研究得到的最好的候选基因有NF1、MED12、NF2、CUL3、TADA2B和 TADA1。通过一系列实验，不同的gRNA靶向相同的基因有很高的命中率，确定Cas9基因筛选前景的光明[4]。

GeCKO筛选是一个系统而独特的方法，用RNA抑制剂干扰基因的功能。RNA抑制剂会减少目标RNA蛋白的表达量，而GeCKO可以引导功能缺失的突变体进入DNA。RNA抑制剂可以限制转录，而Cas9：sgRNAs可以识别基因组内的很多因子，比如启动子：增强子、内含子和基因间隔区。此外，催化Cas9不活跃的突变体可以根据不同功能域被分类，进而扩大其干扰方式，包括基因组功能筛选的应用、Cas9的激活和表观遗传修饰。运用不同sgRNA有效进行完全基因敲除有着高度一致性，因此通过Cas9：sgRNA技术改变基因组的功能是可行的[4]。

二、用CRISPR/Cas系统编辑多种基因

选择性干扰个别基因原件造成的基因突变需要精准有效地基因识别技术，虽然之前已经有ZFs、TALEs等技术可以以DNA为靶标，但是不够有广泛性而且成本较高。因此研究者设计了新的基因编辑工具，这个工具是基于II型原核生物的CRISPR获得性免疫系统的RNA引导Cas9核酸酶制作而来的。II型原核CRISPR的获得性免疫系统已被证明能促进RNA指导的特殊位点DNA切割。研究者设计了两种不同的II型CRISPR系统，并且证明了可以用短序列RNA指导Cas9核酸精准切割在人类以及小鼠细胞内的内源基因座。Cas9也可以修饰成切口酶，用最小的致突变活性促进同源定向修复[5]。

研究者在哺乳动物细胞编码SpCas9和RNaseIII并附上核苷酸定位因子以便区分。这些结构在人类的293FT细胞中表达，说明两种核酸定位因子识别SpCas9很有效果。通过重组、荧光表达、电泳、测序等步骤后发现，RNase III 在protospacer（原型间隔序列）的切割过程中是不需要的，并且当RNase III 不存在的时候，89-nt tracrRNA可以被加工。同样pre-crRNA的成熟也不需要RNase III，这证明可能有内源性RNases可以帮助crRNA前体成熟。去除任何剩余的RNA或Cas9原件会使CRISPR系统的基因组切割活性丢失。因此这些结果证明CRISPR有效介导基因修饰需要三个原件系统。接着研究者以EMX1基因座的原始间隔序列为靶标，探究真核细胞中CRISPR介导的切割效果是否具有普遍性，证明他们设计的驱动pre-crRNA和SpCas9表达载体可行性[5]。

S. Pyogenes CRISPR系统可以在哺乳动物细胞中的异源重组进行方便高效的基因组编辑，并证实CRISPR介导的基因靶标多种人类细胞是十分高效的。在S. Pyogenes CRISPR系统NGG序列的需求限制了靶标间隔（8bp），但探索Cas9家族和不同PAM的需求可以打破这些限制。事实上，其他CRISPR位点很可能被移植到哺乳动物细胞中，比如嗜热链球菌 LMD-9 CRISPR1也可以介导哺乳动物基因组切割[5]。

三、CRISPR/Cas系统与HIV

通过高效的抗逆转病毒可以控制HIV-1病毒的复制，这时候HIV-1病毒处于休眠状态，称之为潜在的前病毒，但它可能在任何时候对人体再次构成威胁。但是，以扰乱HIV-1病毒前体为目标的新技术可能从染上病毒的个体根除病毒基因组。LTR-targeting CRISPR/Cas9组件转染HIV病毒休眠表达处或者已经诱导的T 细胞中，刺激后LTR引起有意缺失表达，从而导致HIV无法致病。通过序列分析证实CRISPR/Cas9系统有效切割靶位点，并引起LTR靶位点突变。研究者成功扰乱HIV-1病毒前体的表达，Cas9蛋白有着RuvC和HNH两个结构域，拥有自主的ssDNA切割活性，而突变体缺失RuvC和HNH其中一部分就会变成内切酶。为了抑制HIV-1 前病毒表达，TAR位点是最理想的靶基因。CRISPR/Cas系统的靶标专一性很强，靶基因的1 个碱基发生突变都有可能导致干扰识别，这意味着一些病毒前体可能从这个基因编辑结构中逃脱。而TAR位点相对比较保守，而且在不同的HIV 病毒亚类中也基本一致。通过研究，作者等人发现CRISPR/Cas9系统编辑HIV-1基因组可以抑制其表达的潜能性[6]。

四、通过CRISPR/Cas介导的基因编辑一步设计带有报道因子的小鼠

研究者通过共注射Cas9 mRNA、不同的sgRNA和不同大小的DNA载体进入小鼠受精卵，构建突变小鼠。通过one-step技术构建出在Nanog，Sox2、Oct4、Mecp2等基因上有荧光信号因子的突变小鼠模型。另外，用sgRNA靶标两个独立的位点在Mecp2基因上，使小鼠约700bp碱基缺失。从而在改造基因的小鼠和胚胎干细胞中分析5种sgRNA脱靶的可能性，并在罕见的例子中识别出脱靶突变体。采用CRISPR/Cas类型II 系统成功生产出了含有5 个基因突变的小鼠[7]。

在这项研究中，证明了CRISPR/Cas技术可以有效应用one-step在精确的基因底座上插入稍短的抗原决定部位或者是稍长的荧光标记，使的小鼠内生基因上带有报告因子更加容易。在有些细胞中脱靶突变体的比例较多，有些细胞中则较少。总之，CRISPR / CAS介导的基因组编辑是一种简单而有效的方法去构建小鼠复杂的基因突变体，比如one-step在小鼠基因上插入内生报道因子。这种方法可以应用在其他哺乳动物上，开放了更多复杂基因编辑的可能性在替他物种之间，但胚胎干细胞（ES cells）不起作用[7]。

五、运用CRISPR/Cas9构建骨髓恶性肿瘤小鼠模型

人类恶性肿瘤通常在4个或更多的驱动基因上都有突变点，用一些传统的方法解释这些基因的复杂程度是很困难的，因此可以采用CRISPR-Cas9基因编辑系统去克服這些困难。通过构建与sgRNAs和Cas9结合的慢性病毒载体，在老鼠单个造血干细胞上改造了多达5个基因，构建出患有骨髓恶性肿瘤的模型。通过在这个载体上的一系列实验，说明通过sgRNA：Cas9慢性病毒载体基因编辑，可以更好反应人类疾病的复杂程度[8]。

展望

ZFNs，TALENs技术已被广泛地用于基因组定点修饰。但是目前为止，无论是ZFNs 还是TALENs 的筛选以及组装过程都存在着较高的技术难度，并且效率较低[9]。CRISPR / CAS系统是一种新的可对基因组进行靶向修饰的系统，Cas 蛋白可以在gRNA 的引导下对外来入侵的DNA 进行定点切割，CRISPR / CAS系统的发现为开发更为简易的高效基因定点修饰技术提供了崭新的平台。但是这个系统还存在着一些局限，例如CRISPR-Cas系统对靶基因的识别依赖于PAM元件，这就限制了其对靶基因的选择，而且存在着脱靶效应。但随着进一步研究这些瓶颈将会被克服。总而言之，CRISPR / CAS，会发展成为一种操作方便、特异性强、切割效率高、并能应用于各种生物的基因组定点修饰技术。

【参考文献】

[1]Prashant Mali，Luhan Yang，Kevin M. Esvelt，John Aach. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science 339，823 （2013）.

[2]Martin Jinek，Krzysztof Chylinski，Ines Fonfara，Michael Hauer. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science，2012，17 August： 816-821.

[3]Masafumi Inui，Mami Miyado，Maki Igarashi，Moe Tamano. Rapid generation of mouse models with defined point mutations by the CRISPR/Cas9 system. Science，2014，23 Jun;4：5396.

[4]Ophir Shalem，Neville E. Sanjana，Ella Hartenian，Xi Shi. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Science 343，84 （2014）.

[5]Le Cong，F. Ann Ran，David Cox，Shuailiang Lin. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science，339，6121 （ 2013 ）.

[6]Hirotaka Ebina，Naoko Misawa，Yuka Kanemura & Yoshio Koyanagi. Harnessing the CRISPR/Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus. Science，2013; 3：2510.

[7]Hui Yang，Haoyi Wang，Chikdu S. Shivalila，Albert W. Cheng. One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell，2013 Sep 12;154（6）.

[8]Dirk Heckl，Monika S Kowalczyk，Dad Yudovich，Roger Belizaire. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology，2014 Sep;32（9）.

[9]Wenyan Jiang，David Bikard，David Cox，Feng Zhang. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology，2013 Mar;31（3）.