基于二次回归旋转正交法优化香菇多糖的提取工艺

张弘弛，刘瑞*，焦乐乐，周凤，李慧，杨阳

(1.大同大学 生命科学学院，山西 大同 037009；2.大同大学应用生物技术研究所，山西 大同 037009)

香菇(Lentinusedodes(Berk.) Sing)，又称香菌，自古以来就有“山珍之王”的称号，其食用量仅次于世界第一食用菌蘑菇，在营养价值和食用价值方面应用前景很大[1]。香菇中富含人体必需的氨基酸[2]、各类维生素、矿物质和嘌呤等营养成分，特别是香菇多糖成分[3]。香菇多糖具有多种生物学功能，多糖能够参与人体抗原抗体的特异性免疫反应，使T淋巴细胞的功能变为原来的正常水平，从而达到抗肿瘤的功效[4]。香菇多糖对于大多数病毒具有直接或者间接的抑制作用，能够刺激人体细胞释放特异性抗体，该抗体可以有效抑制多种病毒[5]。香菇多糖还具有清除DPPH自由基能力，并且对羟自由基也有很好的抑制作用[6]。香菇多糖可降低肝糖原含量，具有保肝解毒的作用。此外，香菇多糖还具有降血糖、降血脂等功效[7]。

目前，香菇多糖的提取方法主要有：热水浸提法，此法容易操作，对设备的要求较低[8]，对药品的要求低，具有维持多糖生物学活性不变的优点，并且提取工艺成本较低，非常适合大规模生产，因而被绝大多数工业生产所采用。微波法提取，该方法能够弥补热水提取耗时的缺点[9]，微波能穿过细胞膜, 直接作用于植物的细胞[10]，当使用微波处理时，温度急剧上升使细胞扩大膨胀，从而导致细胞膜破裂，细胞的内容物分散出来[11]。超声辅助提取法，此法利用超声波频率控制引起的空化作用，使得植物细胞破碎，细胞膜被破坏[12]，但是对多糖的结构无影响，多糖能够迅速地溶解在溶剂中[13]。该法在提高多糖提取率、减少提取时间、便于操作等方面表现得尤为突出[14]。

相对于一般的正交试验方法，二次回归正交旋转组合设计试验具有模型覆盖率全面、分析结果更接近实际值、回归方程相关性好等优点[15]。因而，本研究试验设计依据单因素结果，采用二次回归旋转正交法对香菇多糖的提取率进行分析，研究影响香菇多糖提取过程中因素之间的协同和交互作用，从而获得最优的香菇多糖提取条件，为精密的香菇多糖工业提取工艺提供基础研究数据[16]。

1 材料与方法

1.1 材料

干香菇：购于上海蛎赫生物科技有限公司；葡萄糖：天津市化学试剂供销公司；苯酚、无水乙醇、浓硫酸：天津化工研究所：水：蒸馏水，自制。

1.2 仪器

HH-6数显恒温水浴锅 金坛市国旺实验仪器厂；UV-3200S紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；Scientz-1000C 超声波萃取仪 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 苯酚-浓硫酸法测定多糖含量

1.3.1.1 葡萄糖标准曲线

精确称取10 mg的葡萄糖对照品粉末于烧杯中搅拌溶解，倒入100 mL容量瓶中定容至刻度，即制成0.1 mg/mL的葡萄糖标准样品溶液[17]。按表1配制不同浓度梯度的溶液，摇匀，置于50 ℃温水中反应10 min，降温终止反应。采用紫外可见分光光度计在490 nm波长下测定吸光度值，重复3次取平均值。其中，1号试管中的溶液为空白对照。

表1 溶液配制表Table 1 The preparation of solution

1.3.1.2 香菇多糖提取率的计算

取1支洁净的试管，用移液枪准确量取1 mL制备的香菇多糖提取溶液放置其中，按照上述方法测定吸光度A。香菇多糖提取率及得率的计算公式：提取率=(香菇多糖的浓度×定容后的体积×稀释倍数)/香菇粉末的质量×100%。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 浸提时间对香菇多糖提取的影响

称取6份3 g香菇粉末分别置于锥形瓶中并编号。按照1∶40(g/mL)的料液比加蒸馏水，将溶液在50 ℃恒温水中浸提0.5，1，1.5，2，2.5，3 h后，设定超声功率1000 W，45 ℃下超声辅助提取30 min。超声后，将试液转入离心管以8000 r/min离心3 min。弃沉淀对上清液进行抽滤，将滤液转移至锥形瓶中待用。按上述方法测定香菇多糖提取率。试验结果分析和绘图采用Origin 2017，下同。

1.3.2.2 料液比对香菇多糖提取的影响

称取6份2 g香菇粉末于锥形瓶中并编号。按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL)的料液比加蒸馏水混匀，设定超声功率1000 W，45 ℃下超声辅助提取30 min。相同步骤测定香菇多糖提取率。

1.3.2.3 超声时间对香菇多糖提取的影响

称取6份3 g香菇粉末于锥形瓶中并编号。按照1∶40(g/mL)的料液比加蒸馏水混匀，设定超声功率1000 W，45 ℃下超声辅助提取，超声提取时间设定为0，10，20，30，40，50 min。相同步骤测定香菇多糖提取率。

称取6份3 g香菇粉末于锥形瓶中并编号。按照1∶40(g/mL)的料液比加蒸馏水混匀，设定超声功率1000 W，超声辅助提取30 min。超声温度分别为20，30，40，50，60，70 ℃。相同步骤测定香菇多糖提取率。

1.3.2.5 超声功率对香菇多糖提取的影响

称取6份3 g香菇粉末于锥形瓶中并编号。按照1∶40(g/mL)的料液比加蒸馏水混匀，热水浸提1 h，45 ℃下超声辅助提取30 min。超声功率分别为400，600，800，1000，1200，1400 W。相同步骤测定香菇多糖提取率。

1.3.3 二次回归旋转正交组合试验设计

根据单因素试验的结果，筛选确定出4个单因素的5个较佳水平。该试验以这4个因素为自变量，设计得到表2的因素编码表。试验结果分析和绘图采用DPS 7.05。

表2 正交试验因素水平编码表Table 2 The factors and levels of orthogonal test

1.3.4 验证性试验

如图3所示，在功能划分上，DSP28335仅用于回波信号经功率放大、滤波、A/D转换后的数据处理，由于运算量较大，尽可能地节约DSP28335的片内资源，障碍物的距离信息最终在DSP28335中运算获得，之后通过操作地址总线与数据总线存储于双口RAM中。STM32F103相对于DSP28335运算能力较差，因此在该系统中分配为LCD显示、串口通信、参数储存、信号发射等对运算速度要求相对较低的功能。目标的距离信息在DSP28335存储到双口RAM后，STM32F103可以实时获取该输入值，双口RAM可供DSP28335与STM32F103同时读写，方便快捷。

按照二次回归旋转正交试验设计的优化方案进行验证，得出的试验结果与模型预测值进行比较，判断回归模型结果的稳定性和准确性。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

试验得到的标准曲线方程为Y=3.1858x+0.0127，R2=0.9989，因此该方程具有良好的线性关系。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 浸提时间对香菇多糖提取的影响

图1 浸提时间对香菇多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides from Lentinus edodes

由图1可知，当热水浸提时间由0.5 h按梯度升高到3 h时，香菇多糖得率呈现出先升高再降低的倒U形曲线。当浸提时间为1.5 h时达到最高值，时间继续延长时，多糖得率反而呈现下降的趋势。这是因为浸提时间过长时，胞内水解酶游离至提取液中，部分多糖被水解。因此综合考虑取0.5～2.5 h作为浸提时间的5个水平。

2.2.2 料液比对香菇多糖提取的影响

图2 料液比对香菇多糖提取率的影响Fig.2 Effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate of polysaccharides from Lentinus edodes

由图2可知，当料液比由1∶10 按梯度升高到1∶60，香菇多糖得率呈现出先升高再降低的趋势。料液比为1∶30时提取率最高。这是因为料液比倍数低时，溶质和溶液的接触面积小，提取不充分，导致得率偏低；随着倍数增加，溶液的密度随之降低，能够充分提取。综合考虑，料液比的5个水平为1∶20～1∶60。

2.2.3 超声时间对香菇多糖提取的影响

图3 超声时间对香菇多糖提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides from Lentinus edodes

由图3可知，当超声时间升高到60 min时，香菇多糖得率呈现出先升高再降低的趋势。超声时间为40 min时多糖得率达到最高值，超声50 min后，多糖提取率明显下降。故取10～50 min作为超声提取时间的5个水平。

2.2.4 超声温度对香菇多糖提取的影响

由图4可知，当超声温度由20 ℃按梯度升高到70 ℃，香菇多糖得率呈现出先升高再降低的趋势。当超声温度达到50 ℃时，提取率达到最大值。这是因为多糖在高温下会分解成小分子物质，因此温度过高提取率降低。但是温度为70 ℃的提取率要高于20 ℃，说明超声辅助热水浸提比常温水提效果显著。故取水温为30～70 ℃作为超声温度的5个水平。

图4 超声温度对香菇多糖提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of polysaccharides from Lentinus edodes

2.2.5 超声功率对香菇多糖提取的影响

图5 超声功率对香菇多糖提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides from Lentinus edodes

由图5可知，在设置的超声功率范围(400～1400 W)，香菇多糖提取率波动范围不大(从10.3%上升至11.35%)，在超声功率800～1400 W几乎恒定(提取率在11.2%～11.4%之间)，提取率达到最大值，说明在此范围内细胞的超声破碎效果已达到峰值。因而从节约能量的角度考虑，超声功率确定为800 W，后续二次回归旋转正交试验不再考虑超声功率的影响。

2.3 优化试验结果

2.3.1 二次回归旋转正交组合的试验结果

试验方案及结果见表3。采用DPS 7.05软件对试验数据进行回归分析，总共有36组试验，其中有12组是为了消除试验的系统误差及人为误差法的零点误差重复试验。得到的香菇多糖提取率(Y)与4个因素的二次回归模型为：

Y=13.65000-0.45833X1+0.87000X2+0.44167X3+0.37500X4-0.17417X12-0.94167X22-0.23667X32-0.31167X42-0.16250X1X2+0.10000X1X3-0.45000X1X4-0.17500X2X3+0.27500X2X4-0.38750X3X4。

表3 二次回归旋转正交组合试验设计及结果Table 3 The design and results of quadratic regression rotation orthogonal combination test

在α=0.01的显著水平下，软件智能除去不显著的X12、X1X2、X1X3、X2X3、X2X4，得到优化后的回归方程为：

Y=13.65000-0.45833X1+0.87000X2+0.44167X3+0.37500X4-0.94167X22-0.23667X32-0.31167X42-0.45000X1X4-0.38750X3X4。

香菇多糖提取率与浸提时间、料液比、超声时间、超声温度这4个因素的相关系数(R2)=回归平方和/总平方和=73.4359/85.8764=0.8551，从该系数可以得知香菇多糖的提取率由这4个因素所影响的百分比为85.51%，其他各种因素及其误差所影响的百分比为14.49%。

上述二次回归方程中的X1(浸提时间)、X2(料液比)、X3(超声提取时间)、X4(超声提取温度)，试验结果的方差分析及可信度分析见表4。

表4 方差分析表Table 4 The variance analysis results

由表4可知，回归方程的失拟检验F1值为1.73324<2.948[18]及F0.01(10，11)=2.25，P=0.1385>0.05，说明失拟性差异在本试验中不是很显著，因此使用正交模型是很恰当的。回归方程的显著性检验F2=8.85445>3.03及F0.05(14，21)=3.49，P=0.0001<0.001，此数据说明回归是极显著的。由此可以说明，本模型对香菇中多糖的提取含量有着较准确的预测。其中，因素X1、X2和X22对香菇多糖的提取有极显著影响(P<0.01)。F值越大，该单因素对香菇多糖提取率的影响越大，对提取工艺的优化也就越重要[19]。由表4可知FX1=8.5105，FX2=30.6642，FX3=7.9028，FX4=5.6971。根据F值可对各因素影响香菇多糖提取的效果进行排序：料液比X2>浸提时间X1>超声温度X3>超声时间X4。

2.3.2 单因素效应分析

运用控制变量法，将其中的一个因素固定在零水平，分别对其余的3个因素进行考察并作图，分析这些因素对香菇多糖提取率的影响效果。

图6 单因素效应分析图Fig.6 Effect of each factor on extraction rate

由图6可知，超声时间和超声温度这两个因素呈现出正相关性，随着因素水平的增加，多糖的提取率也在逐渐增加；但是增加浸提时间，多糖的提取率基本不变且略微下降，说明浸提时间对提取率的影响不显著；料液比在一定的范围内增加时，提取率也相应地增加，如果超出这个范围，提取率就开始有下降趋势。

2.3.3 浸提时间与超声温度的交互作用分析

图7 浸提时间与超声温度的交互图Fig.7 Effect of interaction between extraction time and ultrasonic temperature

从优化后的回归方程中可以得出，浸提时间(X1)和超声温度(X4)、超声时间(X3)和超声温度(X4)都存在互作效应，对香菇多糖的提取率有显著影响，均存在协同效应。其他两两因素之间也均存在互作，但显著性不是特别明显。由图7可知，当超声时间和料液比恒定在零水平时，反映出X1与X4两因素之间有很强的交互作用。当X1为0.5 h、X4为60 ℃时，达到最高的提取率。这是因为超声时间比较长时，对于料液比的要求也会相应地增加，延长空化作用时间能够促进料液比低的样品内多糖都溶解在水中。由此可知，该提取工艺应当相应地选择较高且适宜的超声温度并且选择合适的浸提时间，从而既能节省时间，又可提高提取率。

2.3.4 超声时间与超声温度的交互作用分析

图8 超声时间与超声温度Fig.8 Effect of interaction between ultrasonic time and ultrasonic temperature

由图8可知，当料液比和浸提时间为零水平时，X3和X4的交互作用对多糖提取率的影响极明显。根据交互图中的截面曲线进行分析，可知当超声时间为20 min、超声温度为60 ℃时，交互曲面达到最高点，多糖提取率达到最大值。随着X3和X4的水平升高，香菇多糖的提取率先上升后下降。这是因为时间和温度对提取率的影响都很显著，并且二者是同一个仪器同时进行，所以相互作用也就更强一些。由此可知，在香菇多糖的优化提取工艺时，必须注意超声时间和超声温度的变化范围。

2.4 验证试验结果

模型预计香菇多糖的提取率为15.97%，试验测得实际的平均多糖提取率为15.86%。为了避免误差，此验证试验重复3次，软件预测值与实际测得值相差不大，说明该模型可靠性高。同时相对于各个单因素试验，在优化后的工艺条件下，香菇多糖的提取率明显提升。

3 结论与讨论

通过对多个单因素进行预试验，本研究选择其中影响最显著的4个单因素，获得了5个水平，按照因素水平编码表应用二次回归旋转正交设计组合法对香菇多糖的提取方案进行优化。从而获得最佳提取操作条件：浸提时间为0.5 h，料液比为1∶40，超声时间为20 min，超声温度为60 ℃。经过多次验证试验，证明该提取工艺稳定可靠。

在本试验中，提取的生物大分子为香菇中的多糖，虽然香菇中的多糖有着各种各样的生物学活性，但是香菇多糖极其不稳定，温度过高会导致多糖的分解或者结构发生改变，从而生物学活性降低，所采用的材料是购买的干香菇，试验材料的干燥方式不明确，可能造成香菇多糖损失，使其提取率比实际含量低。香菇多糖的单糖单元也各有不同，主要有两种形式，分别为同多糖和杂多糖。标准曲线的绘制是以葡萄糖作为标准品，同多糖又为葡聚糖，它的单糖单元为葡萄糖；但是杂多糖的单糖单元有较大差异，使用该标准曲线并不能够将所有的多糖检测计算。后续研究中，在前期试验的基础上，我们会进一步精细化研究方案，进行更加精确的试验。