超高效液相色谱－串联质谱法同时测定蜂蜜中的多类植物毒素

张 帅 孟 娟 张 晶 许 莉 刘先军 邵 兵

（1.北京市疾病预防控制中心，食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室，北京100013；2.北京微量化学研究所，北京100091；3.国际关系学院，北京100091）

蜂蜜是一种深受消费者喜爱的药食同源产品。随着人们健康保健意识的不断提高，其需求量逐年增长，进口数量也呈现明显递增趋势[1]，与此同时，蜂蜜的安全性也受到了广泛重视[2]。然而，以往的研究多集中于蜂蜜的农兽药残留[3]或者外源性的掺假方面，对内源性的污染关注相对较少。由于蜜蜂可在蜂巢周边平均7 km2范围内采集多种植物的花蜜[4]，因此极有可能同时暴露在多类有毒生物碱下，如雷公藤类和吡咯里西啶类生物碱。雷公藤类化合物主要来源于卫矛科雷公藤属植物，主要用于治疗自身免疫性疾病，如风湿性关节炎[5～6]和系统性红斑狼疮[7]。大部分雷公藤中的萜类化合物除有一定的治疗作用外，还对肾脏[8]和肝脏[9]有严重的毒副作用，在临床上其毒副作用发生率接近60%[10]；近年来常有因食用含有雷公藤类生物碱的蜂蜜而中毒甚至死亡的报道[11～12]。吡咯里西啶类生物碱（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）在大自然中广泛存在，KEMPF等[13]总结了蜂蜜和花粉中PAs的基本情况，SCHRAMM等[14]综述了植物中的PAs的生物合成路径、毒性和存在情况。德国联邦风险评估研究所（BfR）指出，PAs不仅会导致严重的肝损伤，还具有遗传毒性[15]。此外，倍半萜内酯类化合物马桑宁[16]和羟基马桑毒内酯[17]也都有一定的毒性；异喹啉类化合物小檗碱虽然毒性较低，却可导致新生儿和胎儿核黄疸或加重[18]。鉴于这些植物毒素可能在蜜源地同时存在，可能会带来潜在的健康风险，需要建立相应的便捷、快速、灵敏的检测方法。

现有文献报道蜂蜜中植物毒素的检测方法主要有液相色谱－串联质谱[19]、气相色谱－串联质谱[20]和液相色谱－四级杆－飞行时间质谱[21～22]。其中液相色谱－串联质谱已被证明是定量分析各种残留物和污染物的有力工具[23～24]，可用于蜂蜜中多种植物毒素的同时准确定性和定量分析。在复杂基质中化合物的准确定量会受到严重影响，而样品的净化方法也会对灵敏度和准确性造成一定影响。目前蜂蜜样品净化方法多是固相微萃取[20]和QuEChERS[21～22]技术。鉴于被测定的多种化合物极性差别较大，固相微萃取不能同时满足对这些化合物基质去除效果和回收率要求，本文选择了操作简便、省时的QuEChERS净化方法，结合超高效液相色谱－串联质谱法（UPLC－MS/MS）建立了同时对蜂蜜中多种植物毒素的定量分析方法。

一、材料与方法

（一）仪器超高效液相色谱－Xevo TQ－S三重四极杆串联质谱仪（美国沃特世公司）；AL204型电子天平（瑞士梅特勒－托利多仪器公司）；Allegra X－22R多功能台式高速离心机（美国贝克曼公司）。

（二）试剂与样品甲醇、乙腈（色谱纯，美国霍尼韦尔国际公司）；氯化钠（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；硫酸镁、甲酸（分析纯，百灵威科技有限公司）；N－丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）（美国默克公司）。

马桑宁、雷公藤吉碱、雷公藤次碱、雷公藤定碱、雷公藤春碱、雷酚内酯、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素、兰蓟定、克氏千里光宁、倒千里光碱、千里光宁、野百合碱、千里光菲林、小檗碱、荷叶碱、石松胺、羟基马桑毒内酯（纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司）。

蜂蜜样品92种，购自大型超市、零售店及网上商城，其中2种产自浙江（紫云英蜜和杂花蜜各1种）、3种产自新疆（1种枸杞蜜和2种黑蜂蜜）、3种产自上海（紫云英蜜、洋槐蜜和杂花蜜各1种）、7种是产自河北的洋槐蜜、9种产自北京（7种洋槐蜜、1种荆花蜜和1种枣花蜜）、11种产自辽宁（3种洋槐蜜、3种椴树蜜、3种黑蜂蜜和2种杂花蜜）、21种是产自山东的洋槐蜜、22种是产自陕西的油菜花蜜、9种是产自新西兰的麦卢卡蜂蜜、5种产地不明（3种洋槐蜜和2种枣花蜜）。

（三）实验方法

1.样品前处理。称取1 g蜂蜜样品于10 mL离心管中，用1 mL超纯水溶解后，加入6 mL乙腈，涡旋1 min。之后加入1.0 g NaCl，涡旋1 min，5 000 r/min离心10 min。吸取4 mL上清液于含50 mg PSA的净化管中，涡旋1 min，5 000 r/min离心10 min。准确吸取3 mL上清液，在适当的氮气流下吹干，用100μL甲醇溶解，再用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL，供UPLC－MS/MS测定。

2.仪器条件。（1）色谱条件。色谱柱：BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流动相：A相为甲醇，B相为0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～3 min，10%～15%A；3～5 min，15%～25%A；5～5.5 min，25%A；5.5～7 min，25%～62%A；7～10 min，62%～100%A；10～12 min，100%A；12～12.1 min，100%～10%A；12.1～14 min，10%A；柱温：40℃；流速0.3 mL/min；进样体积：10 μL。（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI+）；检测方式：多反应监测模式（MRM）；干燥气：氮气；离子源温度为150℃；脱溶剂气流速为800 L/h；脱溶剂气温度为400℃；碰撞气流速为0.14 mL/min；毛细管电压为2.5 kV；锥孔电压为35 V。目标物相应的保留时间、监测离子对（m/z）和碰撞能量等参数见表1。

表1 18种植物毒素的MRM模式优化参数

二、结果与分析

（一）色谱条件的优化由于18种目标植物毒素易溶于甲醇和乙腈，因此选择了反相色谱柱和反相色谱常用的流动相体系甲醇－水和乙腈－水进行考察。本文对18种目标化合物的质谱检测均采用正离子模式，甲酸的存在有助于促进其离子化，形成[M+H]+，从而提高分析的灵敏度。本实验主要对比了甲醇－0.1%甲酸水溶液和乙腈－0.1%甲酸水溶液对各待测物的分析效果，结果表明，甲醇－0.1%甲酸水溶液作为流动相时可获得较好的响应值和分离度。18种植物毒素在两种分离体系下的总离子流图如图1所示。

图1 18种植物毒素在不同分离体系下的总离子流图

（二）加水量的优化由于蜂蜜中含水量很少，当用QuEChERS方法提取时，如直接加入有机溶剂进行提取，会因分散性不佳、黏合共沉淀等原因而降低提取效率，因此需要先加入一定量的水把蜂蜜溶解。本文考察了加水量对目标物回收率的影响，结果如图2所示，用0.5 mL水溶解1 g蜂蜜时，多个化合物的回收率都比较低；当加入的水多于1 mL时，野百合碱、石松胺和倒千里光碱的回收率随水体积的增加而下降；用1 mL水溶解时，大多数生物碱可得到理想的回收率，因此本文最终选择用1 mL水溶解1 g蜂蜜。

图2 加水量对回收率的影响

（三）盐析剂的优化MARTINELLO等[22]和TANNER及CZERWENKA[25]在测定蜂蜜中吡咯里西啶生物碱时所使用的盐析试剂为无水MgSO4、NaCl、二水合柠檬酸三钠和一水合柠檬酸二钠的混合物，与市售的盐析试剂配方基本一致。由于QuEChERS前处理过程中加入的盐析试剂主要是使有机相和水相分层，因此考虑尽可能地简化盐析试剂的组成，进而比较了上述组合的盐析试剂（1 g无水MgSO4、0.5 g NaCl、0.5 g二水合柠檬酸三钠和0.25 g一水合柠檬酸二钠）和1.0 g NaCl的盐析试剂对回收率的影响。结果表明，使用混合盐析剂时野百合碱、石松胺和倒千里光碱的回收率为88.1%、58.3%和86.3%，稍高于氯化钠作为盐析剂的体系，而两体系对其他生物碱的回收率几乎没有差异。因此，从操作简便和降低成本方面考虑，选择NaCl作为盐析试剂。

（四）吸附剂的选择QuEChERS净化过程中，最常用的吸附剂包括C18和PSA，其中前者对非极性组分具有很强的吸附性，后者可有效去除甲酸、脂肪酸、极性色素等杂质。MARTINELLO等[22]和TANNER及CZERWENKA[25]在测定蜂蜜中吡咯里西啶生物碱时使用了氨基填料，因此，本研究将净化填料总量设为50 mg，比较了C18、PSA和C18与PSA不同比例组合时对18种植物毒素的净化效果和回收率的影响。结果表明，不同比例的C18和PSA并没有对回收率产生明显影响，但随着PSA比例的降低，兰蓟定、克氏千里光宁、小檗碱、雷公藤甲素、雷公藤内酯酮和雷酚内酯的基质抑制作用明显增强（见图3），推测与PSA的结构和吸附性能有关。PSA为N－丙基乙二胺，属于胺基类吸附剂，对有机酸、色素、糖类等极性物质的去除效率较高。当吸附剂中PSA的比例增高时，提取液中的糖类等杂质的去除效果更好，从而改善了基质抑制。因此，从降低基质效应的角度考虑，本研究选择的净化材料为50 mg PSA。

图3 不同比例C18和PSA组合对目标物基质效应的影响

（五）方法的线性范围、检出限和定量限采用未检出目标化合物的蜂蜜样品所配制成的不同浓度的基质匹配标准溶液，对本试验的方法学参数进行考察。以目标化合物的峰面积（y）对应相应的质量浓度（x，μg/L）绘制基质匹配标准曲线。以信噪比（S/N≥3）确定方法检出限（LOD）；以信噪比（S/N≥10）确定方法定量下限（LLOQ）。18种目标物质的线性范围见表2，从结果可得，18种植物毒素在给定的浓度范围内有良好的线性关系，相关系数（R2）均＞0.99。

表2 18种植物毒素的方法线性范围、检出限和定量下限

（六）方法的回收率与精密度本研究对低、中、高3个加标浓度水平的蜂蜜样品进行分析，考察方法在实际样品分析中的可靠性与稳定性。结果如表3所示，3个加标水平的实际蜂蜜样品中，除石松胺的回收率在48%～60%之间，其他目标化合物的回收率均在70%～112.5%之间，所有化合物的日内精密度RSD≤15.1%（n＝6）。结果表明，该方法具有良好的稳定性与重现性，可用于蜂蜜样品的分析。

表3 18种植物毒素在蜂蜜基质中的回收率和相对标准偏差 （n＝6）

（七）实际样品测定在大型超市、零售店及网上商城购买了92种蜂蜜，其中进口麦卢卡蜂蜜9种。83种国产蜂蜜的产地包括北京、上海、山东、河北、新疆等；从蜜源上看，有洋槐蜜、荆花蜜、枣花蜜和油菜花蜜。采用本试验所建立的方法对这些产品进行了检测，其中26个样品检测出了小檗碱，含量为0.2～49.5μg/kg，7个产自新西兰的样品中小檗碱含量在3μg/kg以上，仅1个产自陕西的样品中小檗碱含量为49.5μg/kg，其余国产样品小檗碱含量均低于1μg/kg；5个样品检测出了石松胺，3个样品为产自新西兰的样品、2个为产自陕西的样品，含量为5.45～16.6μg/kg；3个产自新西兰的产品和1个产自陕西的产品同时检测出了小檗碱和石松胺；其他16种植物毒素均未检出。

由于小檗碱广泛存在于小檗科、罂粟科和毛茛科植物中，且这几个科的植物属种繁多，普遍存在于温带和亚热带地区；石松胺是吡咯里西啶类生物碱中非常常见的一种，且主要存在于紫堇科（菊科）、紫草科和夹竹桃科植物中，这几个科的植物在世界各地较普遍，在我国特别是山西、陕西、甘肃等省较多，在澳大利亚、美国、加拿大、新西兰等国也广泛分布。蜜蜂很容易采集到这几类植物的花粉或花蜜，这也许是有些蜂蜜中含有小檗碱和石松胺的原因。

三、结论

本研究利用乙腈提取蜂蜜样品，用改良的QuEChERS方法净化，并结合超高效液相色谱－串联质谱检测技术，建立了蜂蜜中吡咯里西啶类、雷公藤类、小檗碱、荷叶碱、马桑宁和羟基马桑毒内酯等共18种化合物的快速、高灵敏度定量分析方法。该方法具有较高的重现性和精密度，各项指标均可达到蜂蜜中目标化合物痕量分析的要求，为蜂蜜中植物毒素的污染监测提供了技术支持。