硫磺菌子实体多糖的提取及其抗氧化活性

杨 娟, 林佩婷, 赖滢妮, 吴敏文, 刘新锐, 江玉姬,

(1.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2.福州市农业农村局，福建 福州 350000；3.福建农林大学菌物研究中心，福建 福州 350002)

大型真菌的次生代谢产物丰富多样，部分具有显著的生物活性，是开发新药或特效药的重要来源[1].其中，真菌多糖广泛存在于真菌细胞壁中，且具有良好的生物活性，已成为当今医药和食品工业领域共同关注的焦点[2].

硫磺菌(Laetiporussulphureus)又名硫磺多孔菌，是一种珍稀药食兼用的大型真菌[3-4].硫磺菌含有多糖、三萜等活性成分[5].研究表明，硫磺菌多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌等功效[6]；闫梅霞等[7]发现，硫磺菌菌丝体粗多糖对小鼠Lewis肺癌具有一定的体内抑制作用；王娟等[8]发现，硫磺菌发酵液产物有抗菌作用；胡亚平等[3]研究了硫磺菌多糖的分离纯化方法，且发现纯化后的硫磺菌多糖对胃癌有一定抑制作用.

多糖主要以热水、微波、有机溶剂及超声辅助等方法提取[9-11].其中，超声辅助提取是利用超声引起的空化效应，使原料的微颗粒发生碰撞，增加溶剂的提取面积，从而释放出活性成分[12].超声波提取技术具有操作简便、提取条件温和、提取物结构不被破坏等优点[13].此外，各提取方法可以通过优化工艺参数达到提高得率的目的.常见的优化方法有正交设计法和响应面法:正交设计有局限性，选取的代表点并不能完全反映整体情况，且获得的最佳结果只是测试水平的其中一种组合；而响应面法将数据进行多项式拟合后，以图形表达函数关系，使结果简单明了，易于发现各影响因素与得率的交互关系[14-16].目前，有关硫磺菌子实体多糖(polysaccharides from the fruiting body ofL.sulphureus, LSP)提取条件的优化鲜见报道.本试验以超声辅助法提取LSP，以响应面优化提取工艺，以期为后续的LSP结构鉴定和免疫活性的相关研究奠定基础，同时为相关产品的进一步开发提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

硫磺菌子实体购买于黑龙江省双鸭山绕河供应商.

DPPH标准品购买于北京索莱宝科技有限公司；乙醇、邻苯三酚、Tris-HCl缓冲溶液、盐酸、硫酸亚铁、水杨酸钠、过氧化氢、磷酸盐缓冲溶液、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、抗坏血酸(分析纯)购买于国药集团化学试剂有限公司.

RE52-99旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；离心机，Thermo Scientific ST40；KQ-500VDE超声波清洗仪，昆山超声仪器有限公司；UV-2601紫外分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 LSP提取 硫磺菌子实体粉末制备：将硫磺菌子实体在70 ℃烘箱中烘2 h，用植物粉碎机粉碎后，过80目筛，备用.

LSP的提取参照侯笑笑等[17]的水提醇沉法，并稍作修改.精确称取10 g硫磺菌子实体粉末，超声波辅助提取2次(料液比1∶20、提取时间50 min、提取温度50 ℃ 超声频率55 kHz)，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩至原来体积的1/3，加入5倍体积无水乙醇，4 ℃条件下静置12 h，以4 000 r·min-1的转速离心10 min，弃除上清液；采用Sevage法除蛋白[18]，再用旋转蒸发仪浓缩，去离子水进行透析，真空冷冻干燥后即得到LSP.

1.2.2 单因素试验 称取5份10 g硫磺菌子实体粉末,依次放入1～5编号的锥形瓶中，考察料液比(1∶10、1∶15 、1∶20、1∶25、1∶30)、提取温度(30、40、50、60、70 ℃)、提取时间(30、40、50、60、70 min)对LSP得率的影响，每组试验至少重复3次，取平均值.

1.2.3 优化试验 根据Box-Behnken的中心组合方法，综合单因素试验结果，以料液比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)作为考察因素设计试验方案，每个因素设3个试验水平(表1).

表1 Box-Behnken中心试验因素水平Table 1 Levels of variables tested in Box-Behnken design

1.2.4 LSP得率的计算 LSP得率的计算公式[19]:LSP得率/%=LSP质量/硫磺菌粉末质量×100.

1.2.5 LSP体外抗氧化活性测定 (1)LSP对DPPH自由基的清除率:参照Tang et al[20]的方法略作修改，分别配制不同浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1)样品溶液.取上清液1 mL，分别加0.1 mmol·L-1DPPH(1 mL)充分混匀，避光静置30 min，于517 nm波长下测定光密度，记为Di值；同一操作条件下，用1 mL 95%乙醇代替DPPH溶液与1 mL样品混合均匀为样品参比液，记为Dj值； 1 mL DPPH溶液与1 mL 95%乙醇混合液为空白对照，记为D0值.Vc为阳性对照，每组至少重复3次.按以下公式计算LSP对DPPH自由基的清除率.

DPPH自由基清除率/%=[1-(Di-Dj)/D0]×100

(1)

式中：Di为样品管的光密度，Dj为样品参比液的光密度，D0为空白对照的光密度.

(2)LSP对羟基(·OH)自由基的清除率:参考Liu et al[21]的方法稍作修改，配制不同浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1)样品溶液.在试管中分别加入0.3 mL水杨酸钠(20 mmol·L-1)、1.0 mL硫酸亚铁(1.5 mmol·L-1)、1.0 mL不同浓度的样品溶液和0.7 mL H2O2(6 mmol·L-1)，迅速混匀，37 ℃避光反应1 h，于 510 nm波长下测定其光密度，记为Di值；同一操作条件下，以55%乙醇代替水杨酸钠溶液为样品参比液，记为Dj值；以55%乙醇代替样品为空白对照，记为D0值.以Vc为阳性对照，每组至少重复3次.按照以下公式计算LSP对·OH自由基的清除率.

·OH自由基清除率/%=[1-(Di-Dj)/D0]×100

(2)

式中：Di为样品管的光密度，Dj为样品参比液的光密度，D0为空白对照的光密度.

(3)

式中：Di为样品管的光密度，D0为空白对照的光密度.

1.2.6 数据分析 采用Excel软件对单因素试验结果和抗氧化活性结果作图，用Design Expert 8.0软件对优化试验结果作响应面图和等高线图，用SPSS软件进行单因素方差分析，P<0.05表示差异显著,半最大效应浓度(EC50)通过Graphpad 7.0软件计算.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对LSP得率的影响 由图1A可知：当料液比在1∶10～1∶20之间时，随着料液比的增大，LSP的得率逐渐增大；当料液比为1∶20时(提取温度50 ℃、提取时间50 min)，LSP得率达到最大值(8.42%)，显著高于其他料液比的LSP得率(P<0.05)；当料液比大于1∶20时，LSP得率显著降低(P<0.05).因此，选取料液比为1∶20.

2.1.2 提取时间对LSP得率的影响 设定料液比1∶20、提取温度50 ℃，测定提取时间对LSP得率的影响.由图1B可知：当提取时间为30～50 min时，随着时间延长，LSP得率逐渐增大；当提取时间为50 min时，LSP得率达到最大值(8.51%)；当提取时间大于50 min时，LSP得率显著下降.因此，选取提取时间为50 min.

2.1.3 提取温度对LSP得率的影响 设定料液比1∶20、提取时间50 min，测定提取温度对LSP得率的影响.如图1C所示：当提取温度为30～50 ℃时，随着温度升高，LSP得率逐渐增大；当提取温度为50 ℃时，LSP得率达到最大值(8.53%)；当温度大于50 ℃时，LSP得率显著下降.因此，选取50 ℃为适宜提取温度.

A.料液比；B.提取时间；C.提取温度. 图中不同字母表示在0.05水平上差异显著，相同字母表示差异不显著.图1 LSP提取工艺的单因素试验结果Fig.1 Single factor experiment results of LSP extraction

2.2 优化试验结果

采用Design Expert对BBD(Box-Behnken)试验结果(表2)进行响应面二次回归拟合分析，得到回归方程：Y=8.2+0.13A+0.2B+0.24C-0.18AB+0.051AC-0.12BC-0.58A2-0.43B2-0.57C2，方差分析见表3.

表2 Box-Behnken试验设计方案及结果Table 2 Design matrix and results of Box-Behnken design experiment

表3 二次响应面回归模型方差分析1)Table 3 Variance analysis of quadratic response surface regression model

由图2可知，响应面均向下开口且曲面较陡，随着各因素的水平逐渐提高，LSP得率先增加后减少，均出现LSP得率的最大值.料液比与提取时间、料液比与提取温度、提取时间与提取温度的等高线均呈椭圆形，说明各因素交互作用对LSP得率的影响显著，这与表3中结果相符合.

图2 各因素交互作用响应面图和等高线图Fig.2 Interactive response surface and contour map of various factors

应用分析软件Design Expert 8.0，由RSM(响应曲面法)预测最优值，给出优化后的LSP提取条件：料液比为1∶20.46，提取时间为51.89 min，提取温度为51.95 ℃，预测的LSP得率为8.24%.

为便于操作，将最佳提取条件设置为料液比1∶20、提取时间50 min、提取温度50 ℃进行验证，重复3次，LSP平均得率为8.12%.与理论预测值相比，相对误差小于1%，说明上述模型能较好地反映LSP得率与其影响因素之间的关系.

2.3 LSP体外抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基能力 由图3A可知，随着LSP质量浓度增大，其对DPPH自由基的清除能力增强，LSP质量浓度为2.5 mg·mL-1时的清除率达到95.05%.这说明LSP对DPPH自由基有一定的清除能力，但清除率略低于Vc. LSP清除DPPH自由基率的EC50为1.26 mg·mL-1.

2.3.2 清除·OH自由基能力 由图3B可知，LSP对·OH自由基具有一定的清除作用，且清除率随LSP质量浓度的增大而提高，LSP质量浓度为2.5 mg·mL-1时的清除率达到98.16%.LSP清除·OH自由基的EC50为3.67 mg·mL-1.

A.DPPH自由基清除率；B.·OH自由基清除率；自由基清除率.图3 LSP的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of LSP

3 讨论与结论

本研究基于实验室条件对LSP的提取工艺进行了优化，但如果将其应用于大规模生产，则可能存在局限性.在工业生产中，应综合考虑提取条件的适用性和各种因素的合理性.此外，LSP得率与各因素之间的具体作用关系尚不清楚，后续将对此进行深入研究，以为硫磺菌资源的高效利用提供更多理论依据.