芜菁挥发油对紫外线诱导皮肤光老化大鼠的保护作用

李海珍，祁 瑛，郭胜存，陈湘宏

(1.青海省人民医院皮肤科，西宁 810007；2.郑州大学第一附属医院呼吸与危重医学科，郑州 450003；3.青海大学医学院药学系，西宁 810001)

研究表明，高海拔地区紫外线(UV)的强度明显高于平原地区，皮肤病的发病率较高[1-3]。皮肤光老化是临床常见的皮肤病之一，尤其在高原地区发病率较高，临床表现为皮肤松弛、下垂、色素沉着和角质增厚等。研究报道，皮肤受损后，细胞产生大量活性氧自由基，可直接或间接地作用于细胞DNA，造成DNA的断裂[4-5]。皮肤光老化的过程会引起炎症因子的升高，激活相关信号通路。

芜菁(Brassicarapa)为十字花科植物，是生长在海拔3 800 m以上的药食两用植物。《本草纲目》记载“芜菁苦温无毒，利五脏，轻身益气”。《晶珠本草》记载“芜菁味辛，性温，治培根病、隆病，生赤巴”。现代医学研究表明，芜菁具有抗氧化、降血糖、抗衰老等作用，但在皮肤光老化方面的研究鲜有报道[6-7]。本研究通过探讨芜菁对UV诱导的皮肤光老化的保护作用，为芜菁的临床应用提供参考。

1 仪器与材料

1.1仪器 TL-D/BLB型紫外线杀菌灯(美国飞利浦有限公司)；HKJ-SK03P型弹性水分油光皮肤测试仪(日本HUNTKEY株式会社)；Multiskan FC 型酶标仪(美国Thermo Fisher科技公司)；ABI Q5型荧光定量仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；TGL-16 B型高速冷冻离心机，KA-1000型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；YDS-30型东亚液氮容器(乐山市东亚机电工贸有限公司)；BT224S型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；XW-80A型漩涡混合器(上海医大仪器厂)。

1.2试药 芜菁块根，购自青海省玉树州称多县，由青海大学医学院中药教研室人员鉴定为十字花科植物芜菁(Brassicarapa)。乌拉坦溶液(批号171101，上海展云化工有限公司)；超氧化物歧化酶试剂盒(SOD，批号20180204)，丙二醛试剂盒(MDA，批号20180204)，谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒(GSH-Px，批号20180204)，过氧化氢酶试剂盒(CAT，批号20180204)，均购自南京建成生物有限公司。大鼠透明质酸酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(HA，批号18110156)，大鼠羟脯氨酸ELISA试剂盒(Hyp，批号18110156)，大鼠Ⅰ型胶原酶ELISA试剂盒(Col Ⅰ，批号18110156)，大鼠Ⅲ型胶原酶ELISA试剂盒(Col Ⅲ，批号18110156)，大鼠弹性蛋白酶ELISA试剂盒(NE，批号18110156)，均购自南京菲尔特生物有限公司。总RNA提取试剂盒(批号U85622，天根生化科技有限公司)；反转录试剂盒(批号558800500)，荧光定量PCR试剂盒(批号558800500)，均购自安徽Biosharp生物有限公司。

1.3动物 SPF级SD大鼠，雄性，体质量为200～220 g，购自西安交通大学医学部实验动物中心，合格证号：SCXK(陕)2018-001，分笼饲养；每12 h明暗交替1次，自由饮水，温度为(23±2)℃，相对湿度为50%～60%。

2 方法

2.1动物分组及给药 将40只大鼠随机分为对照组、模型组、芜菁挥发油高(40 g·kg-1)、低(20 g·kg-1)剂量组，每组10只。芜菁挥发油的制备参照课题组前期研究方法[8-9]，取芜菁干燥块根300 g，研末，用超临界二氧化碳萃取仪萃取，萃取条件:压力30 MPa，温度35 ℃，二氧化碳流量 18 mL。取萃取出的挥发油 5 mL，按油∶ 水∶ 阿拉伯胶粉=4∶2∶1的比例研磨均匀，配制成质量浓度为 1 g·mL-1的混悬溶液，避光低温保存备用。造模成功后，芜菁挥发油高、低剂量组灌胃给予芜菁挥发油，对照组和模型组给予等量生理盐水，连续14 d。

2.2模型建立 模型组和芜菁挥发油高、低剂量组大鼠每日进行UV照射，UV波长范围为350～400 nm，每日照射60 min，光源与皮肤的距离为40 cm，持续造模50 d。对照组大鼠正常光照饲养，实验期间大鼠自由进食进水。

2.3皮肤含水量测定 用皮肤含水量测定仪每周检测皮肤含水量。按照公式计算皮肤含水量(V)：V=(M1-M2)÷M1×100%。M1为干燥前质量(mg)；M2为干燥后质量(mg)。

2.4ELISA法测定皮肤组织中的蛋白表达 颈椎脱臼处死大鼠，取1.5 cm×1.5 cm背部皮肤，用预冷的生理盐水进行冲洗，剪碎组织，加入9倍体积的生理盐水和蛋白裂解液，组织匀浆，以3 000 r·min-1离心20 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定透明质酸、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、弹性蛋白和脯氨酸的蛋白表达。

2.5皮肤组织中SOD、GSH-Px和CAT的活性以及MDA含量测定 颈椎脱臼处死大鼠，取1.5 cm×1.5 cm背部皮肤，用预冷的生理盐水进行冲洗，剪碎组织，加入9倍体积的生理盐水和蛋白裂解液，组织匀浆，以3 000 r·min-1离心20 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定SOD、GSH-Px和CAT的活性以及MDA的含量。

2.6ELISA法测定血清中核因子-κB(NF-κB)、Toll样受体4(TLR4)、分裂原激活的蛋白激酶(P38-MAPK)和磷脂酰肌醇激酶(PI3K)的蛋白表达 用0.2 g·mL-1乌拉坦麻醉大鼠(1 g·kg-1)，腹主动脉取血，置于促凝管中，以3 000 r·min-1离心15 min，分离血清，按照试剂盒说明书测定NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K的蛋白表达。

2.7real-time PCR测定血清中NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K的mRNA表达 采用实时荧光定量PCR测定NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K的mRNA表达，使用GenScript Real-time PCR (TaqMan) Primer Design 设计引物，见表1。严格按照试剂盒说明书操作，提取总RNA，反转录cDNA，以cDNA模板进行real-time PCR。扩增条件：预变性95 ℃、10 min，变性95 ℃、15 s，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，共30个循环；以2-△△CT值表示目标基因NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K mRNA表达。

表1 大鼠基因引物序列

3 结果

3.1芜菁挥发油对皮肤光老化大鼠皮肤含水量的影响 见表2。由表2可知，与对照组比较，模型组大鼠皮肤含水量在造模后第28天开始显著降低(P<0.05)。与模型组比较，芜菁挥发油高剂量组在第35、42、49天皮肤含水量显著升高(P<0.05)，低剂量组在第35、42、49天皮肤含水量显著升高(P<0.05)。对照组各时间点皮肤含水量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 芜菁挥发油对大鼠皮肤含水量的影响

3.2芜菁挥发油对皮肤光老化大鼠透明质酸、羟脯氨酸、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和弹性蛋白表达的影响 见表3。由表3可知，与对照组比较，模型组大鼠皮肤组织中透明质酸和羟脯氨酸的蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较，芜菁挥发油高、低剂量组的透明质酸和羟脯氨酸的蛋白表达均显著升高(P<0.05)。芜菁挥发油高剂量组透明质酸和羟脯氨酸与对照组透明质酸和羟脯氨酸比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，模型组皮肤组织中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和弹性蛋白的表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较，芜菁挥发油高、低剂量组Ⅰ型胶原蛋白，Ⅲ型胶原蛋白和弹性蛋白的表达均显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。芜菁挥发油高剂量组Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和弹性蛋白的表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。芜菁挥发油低剂量组Ⅲ型胶原蛋白与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 芜菁挥发油对大鼠透明质酸和羟脯氨酸蛋白表达的影响

3.3芜菁挥发油对皮肤光老化大鼠抗氧化指标SOD、GSH-Px和CAT活性及MDA含量的影响 见表4。由表4可知，与对照组比较，模型组大鼠的抗氧化指标CAT、SOD活性明显降低，GSH-Px活性显著升高，MDA含量显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，芜菁挥发油低、高剂量组GSH-Px活性显著降低，CAT和SOD活性明显升高，MDA含量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。结果表明，芜菁挥发油可明显抑制UV对大鼠皮肤光老化造成的脂质过氧化损伤。

表4 芜菁挥发油对大鼠GSH-Px、CAT和SOD活性及MDA含量的影响

3.4芜菁挥发油对皮肤光老化大鼠氧化通路相关蛋白表达的影响 见图1。由图1可知，与对照组比较，模型组大鼠NF-κB、TLR4和P38-MAPK的蛋白表达显著升高(P<0.05)，PI3K的蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较，芜菁挥发油低、高剂量组大鼠的NF-κB、TLR4和P38-MAPK的蛋白表达显著降低(P<0.05)，PI3K蛋白表达显著升高(P<0.05)。芜菁挥发油高剂量组大鼠的NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K的蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 芜菁挥发油对NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K蛋白表达的影响

3.5芜菁挥发油对皮肤光老化大鼠氧化通路相关蛋白mRNA表达的影响 见图2。由图2可知，与对照组比较，模型组大鼠NF-κB、TLR4和P38-MAPK的mRNA表达显著升高(P<0.05)，PI3K的mRNA表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较，芜菁挥发油低、高剂量组NF-κB、TLR4和P38-MAPK的mRNA表达显著降低(P<0.05)，PI3K的mRNA表达显著升高(P<0.05)。芜菁挥发油高剂量组NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K的mRNA表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。芜菁挥发油高、低剂量组的mRNA表达变化趋势与蛋白表达一致。

图2 芜菁挥发油对NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K的mRNA表达的影响

4 讨论

UV所致的皮肤光老化，中医理论认为是光毒侵袭、禀赋不耐。芜菁味苦辛甘，具有利湿解毒的功效，基于中医辨证的角度，芜菁可以治疗UV所致的皮肤损伤。本研究采用目前使用广泛的紫外线灯制备UV诱导的皮肤光老化大鼠模型，该方法简单、准确，模型建立成功率高[10-11]。

Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白是皮肤组织胶原的主要成分，二者相互协作维持皮肤的张力和弹性。在UV照射反复刺激下，二者的比例或含量发生显著变化，从而改变机体皮肤的质量。皮肤发生光老化后，脯氨酰化酶的活性显著降低，羟脯氨酸的合成减少[12-13]。研究结果显示，UV照射后皮肤组织中的含水量显著降低，透明质酸、羟脯氨酸、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、弹性蛋白均显著降低，表明造模成功。在给予芜菁挥发油后，皮肤含水量显著升高，胶原蛋白、弹性蛋白的表达也显著升高，提示芜菁可抑制UV对皮肤的损伤。研究表明，皮肤光老化与氧化应激密切相关[14-15]。细胞可产生大量自由基，引起脂质过氧化反应，对细胞造成损伤[16-17]。本研究通过氧化指标和相关通路探讨芜菁挥发油对UV诱导的皮肤光老化大鼠的作用机制，实验结果显示，UV可显著降低CAT、SOD的活性以及MDA的含量，但GSH-Px的活性显著升高，与文献报道不一致[18]。推测可能是由于氧化应激所致，UV照射大鼠后，机体为清除更多的氧自由基，应激性地升高抗氧化酶活力，从而加快细胞内过剩的自由基，以此达到保护细胞的目的。

NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K是氧化通路中重要的蛋白，一定剂量的UV作用于大鼠后，导致皮肤组织细胞中ROS的含量显著升高，过量的ROS激活NF-κB和TLR4通路，通过级联反应释放大量的炎性因子，引起细胞凋亡[19-20]。本研究结果显示，芜菁挥发油可显著抑制NF-κB和TLR4的蛋白和mRNA表达，减轻氧化通路所致的细胞损伤。P38是MAPK的重要分支，位于NF-κB通路的上游，在氧化应激中发挥重要的作用。本研究结果显示，芜菁挥发油高、低剂量均可降低P38-MAPK的蛋白和mRNA表达。PIK3参与了细胞的凋亡过程，它的活化可以降低细胞凋亡。此外，芜菁挥发油可显著抑制UV所致的PIK3蛋白和mRNA表达的降低，减少皮肤细胞的凋亡，减轻UV对皮肤的损伤。

综上所述，芜菁挥发油可显著减轻UV对皮肤的损伤，具有抗皮肤光老化的作用，其机制可能是通过NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K通路来抑制细胞脂质过氧化，清除体内自由基，从而抑制光老化的发生。