芜菁离体培养再生体系建立

杨洁，贾凯，闫会转，高杰

(新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】芜菁(BrassicarapaL.)是十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)芸薹种芜菁亚种，二年生草本植物[1]。芜菁在我国各地均有栽培；在新疆干旱缺水且盐碱严重的南部地区也有大面积种植。在新疆芜菁被称为恰麻古。前人研究发现[2-9]，芜菁含多种有益元素如氨基酸、蛋白质、皂苷、黄酮类、糖类苷、生物碱类、挥发油、酚类、棕榈酸和硬脂酸等多种脂肪酸，并且还含有铁、钾、锌、钠等大量矿物质元素。【前人研究进展】芜菁肉质根或种子中的营养物质有益成分及其功效[4-12]；提取工艺研究[2-3,13-14]；芜菁花叶病病毒毒相关方面的研究[15-19]；芜菁小孢子培养技术等[1,20-24]。曹亿会[25]、马光[26]均运用芜菁幼苗的子叶及下胚轴建立了其所研究的芜菁品种的再生体系；张鹏[27]、范爱丽[28]在白菜的外植体诱导不定芽的试验中均发现同时添加NAA和6-BA可以提高不定芽的再生频率；甘蓝型油菜外植体再生研究中也有相同发现[29]。【本研究切入点】小孢子培育技术早在1982年就被应用于芸薹属作物[30]，将小孢子技术应用于芜菁育种虽已有多人进行研究，但大规模的培育出完整植株并投入生产的案例还未见报道。利用植物叶片、茎尖等外植体构建再生体系的技术已有很多报道。但是还没有利用新疆芜菁子叶或下胚轴来建立再生体系的实例。研究不同激素对芜菁再生不定芽，不定根的影响。【拟解决的关键问题】研究适用于新疆芜菁及温州盘菜高效的再生体系构建，对比二者对激素响应，为新疆芜菁的选育和基因调控提供新的研究途径。

1 材料与方法

1.1材料

两种新疆芜菁分别为喀什芜菁与柯坪芜菁，在2016年分别采于喀什、柯坪县。温州盘菜(原玉环盘菜)为温州市先丰种子公司生产。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

取生长5 d的芜菁幼苗带柄子叶、下胚轴接种在不同激素配比的MS培养基中，NAA浓度为0.1、0.5 mg/L；6-BA浓度为1、0.75、0.5和0.25 mg/L；以无激素MS培养基为对照。每种激素组合接种35个外植体，重复3次。每5 d统计一次胚轴和子叶再生不定芽数量；培养12 d时更换一次培养基，30 d诱导结束。将产生不定芽的外植体(高约1.5～2 cm)转接至NAA为2 mg/L的1/2MS培养基中生根培养。

再生植株培养20 d后移栽于灭菌基质中(草炭∶珍珠岩∶蛭石=6∶3∶1)，覆膜保湿。将再生植株置于培养箱中培养并观察生长状态。

1.2.2 测量指标

以外植体上有明显可见的小叶时为再生芽标准；外植体上有明显可见的不定根时为再生根标准。每5 d观察记录一次，30 d结束。

不定芽再生率=(不定芽再生外植体数/总接种外植体数)×100%。

不定再生根率=(不定根再生外植体数/总接种外植体数)×100%。

1.3 数据处理

采用Excel2007和SPSS(20.0版)软件进行数据分析、绘制图表，用方差分析法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1植物生长调节剂配比对芜菁子叶再生不定芽的影响

研究表明，子叶为外植体时，0.25 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA激素处理下柯坪芜菁的不定芽再生率最高为32.14%；其余几组间子叶诱导不定芽再生率差异不显著。喀什芜菁子叶诱导不定芽再生率均大于30%(除对照组)；NAA为0.5 mg/L、6-BA为0.25 mg/L时不定芽再生率最高为50.7%；但是随着6-BA浓度增加子叶诱导不定芽的再生率呈下降趋势。NAA为0.1 mg/L时E、F、G、H组子叶诱导不定芽再生率差异不显著(除F组)。温州盘菜子叶的不定芽诱导频率在1.57～24.76，平均再生率为12%；其中D、E、F、G组子叶诱导不定芽的再生率无显著差异。NAA为0.5 mg/L、6-BA为0.25 mg/L时喀什芜菁与温州盘菜的不定芽再生率均达到最高；当不添加任何激素时喀什芜菁与温州盘菜的不定芽再生率为最低。用子叶诱导不定芽时总体诱导频率为喀什芜菁的>柯坪芜菁>温州盘菜。三种芜菁利用子叶诱导不定芽时温州盘菜诱导效果最差。表1

表1 不同激素下芜菁带柄子叶再生不定芽再生率变化Table 1 Effects of different hormoneson on shoot regeneration of turnips petiolate cotyledon explants

注： 数据为平均值， 同列数字旁不同小写字母表示有显著差异(P<0.05),下同
Note：The data is average,there are significant differences in lowercase letters along the same column of Numbers (P<0.05) The same as below

2.2植物生长调节剂配比对芜菁下胚轴再生不定芽的影响

在下胚轴诱导不定芽的过程中，柯坪芜菁对照组下胚轴的诱导率最低为3.9%；下胚轴再生不定芽频率随6-BA、NAA激素的比例的扩大而升高，在6-BA：NAA为7.5：1时萌发率最高为75.32%。此激素比例下下胚轴诱导率高于以子叶做外植体时的最优诱导率。下胚轴诱导时对激素的响应较为敏感。喀什芜菁下胚轴诱导时B组不定芽再生率最低1.9%，总体诱导率变幅较大，最高诱导率为72.55%与最低诱导率差70%。而A、C、D组平均萌发频率为11%，各组间差异不显著。随着6-BA激素增加，E-H组不定芽再生率也升高；G组再生率最高；后随着6-BA浓度继续升高，再生率开始下降。下胚轴诱导不定芽最适宜的6-BA与NAA激素浓度为0.75、0.1 mg/L。与柯坪芜菁利用下胚轴诱导时最适宜的激素浓度一致。温州盘菜下胚轴的不定芽诱导率在17.14%～73.73%；平均再生率为48%。当NAA为0.1 mg/L时下胚轴不定芽诱导率平均在65.51%高于NAA为0.5 mg/L时的不定芽平均再生率14.40%；6-BA与NAA的激素比例在2.5～10：1以内温州盘菜的下胚轴有较好的诱导性能。NAA为0.1 mg/L时三个品种下胚轴诱导不定芽的再生率高于NAA为0.5 mg/L时的再生率。表1，表2

表2 不同激素下芜菁下胚轴再生不定芽再生率变化Table 2 Effects of different hormoneson on shoot regeneration of turnips hypocotyl explants

2.3植物生长调节剂配比及不同外植体类型对芜菁再根的影响

在子叶诱导不定芽过程中，第10 d起部分子叶的基部出现须根，但愈伤组织上并没有不定芽的芽眼；在第12 d时更换培养基后须根生长旺盛但仍未有不定芽。在6-BA为0.75 mg/L、NAA为0.1 mg/L时柯坪芜菁和温州盘菜的生根率达到最高。在NAA为0.1 mg/L时6-BA逐渐升高温州盘菜生根率也升高，并在C组时最高为85.71%。喀什芜菁子叶的生根率在6-BA为1 mg/L，NAA为0.1 mg/L时达到最高；在A、B、C三组处理间无显著差异。

在NAA为0.1 mg/L时下胚轴再生根极少。NAA浓度升为0.5 mg/L后，下胚轴生出须根。E、G、H组柯坪芜菁生根率最高，说明柯坪芜菁下胚轴适宜生根的激素浓度范围较广；F组则是喀什芜菁生根率最高。柯坪芜菁和温州盘菜的下胚轴生根最适激素浓度为6-BA 0.25 mg/L、NAA 0.5 mg/L；喀什芜菁最适激素浓度则为6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L；三种芜菁下胚轴的生根率在各组间差异并不明显。表3

表3 6-BA和NAA下芜菁外植体生根频率变化Table 3 The effect of 6-BA and NAA on the rooting frequency of the turnips

注： 数据为平均值， 同列数字旁不同小写字母表示有显著差异(P<0.05)
Note:

3 讨 论

目前芸薹属芜菁种的植物组织培养已经有大量研究；温州盘菜[25]、津天、赤丸等[26]几个芜菁品种的试验中均发现第5 d的无菌苗离体培养效果较好。曹亿会等[25]发现6-BA在芸薹属组培试验中有较好的诱导效果。试验发现柯坪芜菁和喀什芜菁选择下胚轴为外植体，6-BA为0.75 mg/L，NAA为0.1 mg/L时不定芽再生率较高分别为75.32%、72.55%。温州盘菜同样用下胚轴诱导效果较好，6-BA为0.5 mg/L，NAA为0.1 mg/L不定芽再生率为73.73%。与郭婷婷等[31]发现6-BA∶NAA比例为9∶1时，甘蓝型油菜下胚轴的不定芽再生频率达到96.73%的结果相似。NAA是生长激素被广泛用于植物生根。对比子叶与胚轴的生根情况可发现NAA浓度升高确实有利于胚轴生根；这也许是因为子叶营养含量、内源激素含量高于胚轴，因而在NAA对下胚轴诱导生根呈现出高浓度(0.5 mg/L)促进低浓度(0.1 mg/L)无明显作用的现象。这与杨长友等[32]研究油菜再生苗生根的结果相同。但是NAA的浓度增高子叶的生根率却并未上升，这一现象值得后续试验的继续探讨。

4 结 论

4.1 柯坪芜菁在6-BA∶NAA为7.5∶1时用下胚轴诱导时再生率最高为75.32%；对照组下胚轴的诱导率为3.9%最低。喀什芜菁下胚轴诱导时B组不定芽再生率最低为1.9%，最高诱导率时所用材料和条件与柯坪芜菁一致。温州盘菜最高诱导率为73.73%，此时6-BA、NAA浓度为0.5 mg/L、0.1 mg/L。

4.2 利用下胚轴诱导生根时NAA为0.5 mg/L时胚轴有明显的生根现象，NAA具有促进胚轴生根的作用。柯坪芜菁和温州盘菜的下胚轴生根最适激素浓度为6-BA 0.25 mg/L、NAA 0.5 mg/L；喀什芜菁最适激素浓度则为6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L。柯坪芜菁和温州盘菜子叶的生根率在6-BA为0.75 mg/L、NAA为0.1 mg/L时达到最高；喀什芜菁子叶的生根率在6-BA为1 mg/L、NAA为0.1 mg/L时达到最高。