一株产纤维素酶枯草芽孢杆菌的麸曲制作及其产酶特性研究

郑自强 卫春会 邓 杰 黄治国 仲济宇 任志强

(1.四川轻化工大学生物工程学院，四川 宜宾 644000；2.四川轻化工大学生酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000)

纤维素在动植物中普遍存在，被称为最丰富的可再生能源之一，广泛应用于医药、食品、棉纺、环保行业，具有远大的经济开发前景[1]。纤维素资源的利用经常需要进行降解处理，主要分为物理降解法、化学降解法和生物降解法，生物降解法因其绿色和低能耗的优点备受青睐，而生物降解法一般是通过利用产纤维素酶的微生物来实现的[2]。纤维素酶是由细菌、真菌等微生物产生的能够将纤维素降解成可发酵性糖的一系列酶类的总称，主要由内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶3种酶构成，3种酶类的协同作用才能更好地将纤维素酶解[3]。能够同时产内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶菌株的酶系较为复杂，目前从自然界中筛选出的产纤维素酶菌株存在分解纤维素的酶解效率低，应用于实践生产难的局限性[4]。

选育性能良好的产纤维素酶菌株是利用纤维素的基础。杨伟平等[5]分离出一株能高效降解纤维素的细菌，鉴定为甲基营养型芽孢杆菌；黄玉兰等[6]从土壤中筛选出一株纤维素酶高产菌株XW-1，其最佳的产酶条件下的酶活性为15.60 U/mL；胡丽娟等[7]筛选出一株高产纤维素酶的突变株Y-9，经工艺优化后的酶活性可达28.62 U/mL。以往的研究大多只以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物测定内切β-葡聚糖酶活力作为菌株纤维素酶活力参考，而少有对纤维素酶3种酶的酶活特性进行综合探讨，且对于纤维素生物降解的应用多采用直接接种的方式，造成酶生成量少、酶稳定性差、酶作用效率低等问题，无法满足现阶段工业上的应用需求。

鉴于目前的研究现状，在不降低产纤维素酶菌株的产酶特性条件下扩培菌种以及提高酶的稳定性变得尤为重要，产纤维素酶菌株的大规模应用首先需要扩大培养，制备麸曲是白酒行业比较常见的生产用菌扩培方式。麸曲一般以麸皮为原料，经处理后接种微生物培养产酶，工业上常通过制备麸曲的方式对纯种微生物进行扩培，提高经济效益[7]。研究拟以一株产纤维素3种酶齐全、酶活性高的枯草芽孢杆菌——XWS-A[8]为出发菌株制作细菌麸曲，利用Design-Expert 8.0.6软件设计试验优化工艺扩大菌种，并对成品麸曲的内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活力进行测定，以期改善菌种应用价值，提高资源利用率，为开发利用纤维素资源提供一条新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

XWS-A菌种：酿酒生物技术及应用四川省重点实验室；

麸皮：市售；

羧甲基纤维素钠：淄博海澜化工有限公司；

微晶纤维素：河南德鑫化工实业有限公司；

水杨苷：上海源叶生物科技有限公司；

纤维素酶、(NH4)2SO4、KH2PO4、DNS试剂：分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器及设备

电子天平：CP214型，奥豪斯仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-1200型，翱艺仪器上海有限公司；

高速冷冻离心机：5430R型，德国Eppendorf公司。

1.3 培养基

羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基：羧甲基纤维素钠10 g/L，(NH4)2SO44 g/L，NaCl 1.25 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，琼脂粉18 g/L，pH 7.0；

LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂粉18 g/L，pH 7.0。

1.4 试验方法

1.4.1 麸曲枯草芽孢杆菌生物量测定 取10 g样品(麸曲)加入90 mL无菌水，作为10-1浓度，采用LB培养基稀释涂布计数[9]。

1.4.2 麸曲工艺流程

1.4.3 枯草芽孢杆菌麸曲制作单因素试验 以芽孢杆菌生物量为指标，在前期预试验的基础上，确定原料采用全麸皮，固定培养时间为60 h，分别考察不同接种量(1%，3%，5%，7%，9%，11%)、培养温度(30，35，40，45，50，55，60 ℃)和含水量(30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%)对麸曲中XWS-A菌株生物量的影响。

1.4.4 枯草芽孢杆菌麸曲制作的响应面优化 根据单因素结果，运用Design-Export 8.0.6软件设计试验Box-Behnken中心组合，以芽孢杆菌生物量为响应值，选取接种量、培养温度和含水量为试验因素，确定强化麸曲的工艺最优点[11]。

1.4.5 麸曲纤维素酶活力的测定

(1)标准曲线绘制：分别在比色管中加入1.0 g/L的葡萄糖标准溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，各管分别补离子水至1 mL，再分别加入1.5 mL DNS试剂，沸水浴5 min，冷却后稀释至刻度线(25 mL)，以不加葡萄糖标准溶液为空白，540 nm处测定吸光值。

(2)纤维素酶活力检测(DNS法)：分别在比色管中加入0.5 mg/mL酶液0.1 mL和质量分数为1%缓冲液0.9 mL(内切β-葡聚糖酶活力测定采用羧甲基纤维素钠柠檬酸缓冲液；外切β-葡聚糖酶测定采用微晶纤维素柠檬酸缓冲液；β-葡萄糖苷酶测定采用水杨苷柠檬酸缓冲液)，调节pH，一定温度条件下水浴10 min，加入1.5 mL DNS溶液终止反应，沸水浴5 min，冷却后稀释至刻度线(25 mL)，以先加入DNS溶液，后加入缓冲溶液和酶液作为空白，540 nm处测定吸光值[12]。

(3)纤维素酶活力的定义：在37 ℃，pH 5.5的条件下，每分钟从质量浓度为4 mg/mL 的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1 μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U，每1 min水解产生1 μ/g还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U/g)[13]。

以上试验均测定3次，结果取平均值，并做3次重复。

1.5 数据处理

使用Design-Export 8.0.6软件进行响应面设计、方差分析及模型预测，采用SPSS 22.0数据分析软件对试验结果进行多重比较和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由图1可知，最佳接种量为7%，最佳培养温度为45 ℃，最佳含水量为45%，并以此结果为基础设计响应面水平中心点。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2 Box-Behnken响应面试验

Box-Behnken响应面设计各因素及水平见表1，试验设计及结果见表2。

表1 Box-Behnken响应面设计各因素及水平

表2 Box-Behnken响应面设计及结果

对结果进行二次多元分析，得到拟合评分结果的二次多元的编码方程为：

Y=4.44+0.15A+0.18B+0.17C-0.025AB-0.13AC-0.075BC-0.28A2-0.28B2-0.23C2。

(1)

图2 预测对应关系图

表3 中心组合的回归方程方差分析

由图3可知，接种量与培养温度、接种量与含水量、培养温度与含水量的交互图均呈椭圆形，3D立体图存在极点值，说明各因素之间交互作用显著，各因素交互作用对麸曲生物量结果有较大影响。模型分析预测的最大值为4.5，对应的实际值为A=7.4，B=46.3，C=46.4。考虑到试验操作的方便性，将结果修正为A=7.5，B=46，C=46，即模型预测的最佳工艺为：接种量7.5%，培养温度46 ℃，含水量46%。

图3 交互作用响应分析图

为验证响应面设计结果的可靠性，在最佳工艺参数条件下即控制接种量7.5%，培养温度46 ℃，含水量46%，进行多次验证实验，结果表明，此条件下的成品曲生物量结果为(4.5±0.3)×1011CFU/g，与预测结果4.5×1011CFU/g接近，证明该响应面模型理想，参数组合稳定可靠。

2.3 pH及反应温度对枯草芽孢杆菌麸曲纤维素酶活性的影响

通过Box-Behnken响应设计优化制曲工艺，成功对枯草芽孢杆菌XWS-A进行扩培，而纤维素酶的测定没有具体的标准，甚至同一种测定方法中，处理条件的差异对酶活的测定结果也会产生较大影响[16-17]，考虑到纤维素酶的酶学性质，试验测定在不同pH及反应温度条件下枯草芽孢杆菌XWS-A麸曲的酶活，结果见图4。

由图4可知，内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶与β-葡萄糖苷酶在pH为5.0时，酶活力达到最大值，分别为(2 420±70)，(15±1)，(19±1)U/g；酶是蛋白质，高温会使蛋白质失活，内切β-葡聚糖酶活性在55 ℃时酶活力达到最大值(2 510±70)U/g；外切β-葡聚糖酶活性在55 ℃时酶活力达到最大值(15±2)U/g；β-葡萄糖苷酶活性在60 ℃时酶活力达到最大值(30±3)U/g。综合上述结果，确定试验成品曲纤维素酶的酶活测定应控制pH为5.0，内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶的反应温度为55 ℃，β-葡萄糖苷酶的反应温度为60 ℃。

图4 不同处理条件对纤维素酶活测定的影响

3 结论

以XWS-A为出发菌株制作麸曲，通过响应面设计优化制曲工艺，并对成品曲的产酶特性进行了研究。其最佳工艺为：控制接种量7.5%，培养温度46 ℃，含水量46%。该条件下XWS-A获得了有效的增殖，其成品曲的生物量达到了(4.5±0.3)×1011CFU/g，实现了XWS-A的扩培。

不同测定条件下内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的活性皆有较大差异，在最佳测定条件下内切β-葡聚糖酶活力为(2 510±70)U/g，外切β-葡聚糖酶的活力为(15±2)U/g，β-葡萄糖苷酶的活力为(30±3)U/g。

但研究还存在部分待解决的问题，如尚未大量开展中试及实际工业生产试验，缺乏对纤维素资源的多种途径开发的实际生产数据，下一步将计划从食品、环保、造纸等方向解决此问题，以进一步完备理论支撑依据。