骨关节炎大鼠软骨组织中生物钟基因及蛋白的表达变化

张晓冬，温亮

首都医科大学附属北京朝阳医院骨科，北京100020

骨关节炎（OA）为一种常见的关节退行性病变，好发于中老年人群，发病率与年龄呈正相关［1］。目前OA 的治疗仅限于缓解疼痛症状或接受关节置换，尚无更好的解决方法。研究发现，OA 的发生与软骨细胞生物钟紊乱有关。哺乳动物的生物节律受中枢及外周生物钟的调控，中枢生物钟位于下丘脑视交叉上核（SCN），可产生自主生物节律；外周生物钟位于心脏、肌肉、软骨等，可调控局部组织生物钟，其中位于软骨组织中的生物钟基因及蛋白可以调控“休息时软骨细胞的修复”以及“运动时软骨细胞的磨损”之间的平衡。如果该平衡能够保持，则OA 不会发生［2-4］。控制软骨细胞生物钟的基因及蛋白主要有两对，对生物钟起激活作用的BMAL1 和CLOCK 及起抑制作用的 PER1 和 CRY1。OA 患者BMAL1 基 因 和 蛋 白 表 达 降 低［5-6］，但 OA 患 者CLOCK、PER1 和CRY1 基因及蛋白的表达尚未明确。2020 年 6 月—12 月，我们观察了 OA 大鼠软骨组织生物钟基因及蛋白的表达变化。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 6周龄雄性SD 大鼠24只，购自中国药品生物制品检定所，动物许可证号：SCXK（京）2014-001，无特殊病原体级，质量200～230 g，饲养于清洁级动物房，常规饲料喂养，每日加水，每周更换1次垫料。盐酸氨基葡萄糖（普力得），北京康比得药业有限公司生产，批准文号：国药准字H20070173，规格：0.24 g×42 粒。PCR 相关试剂：Power SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒（日本TOYOBO 公司，QPK-201）；逆转录试剂盒（美国Promega 公司，A3500）；引物由广州复能公司Genecopoeia 代合成。Western blotting 相关试剂：SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（中国索莱宝，P1200），Western blotting 蛋 白 Marker（美 国 Thermo Fisher，26610）；5×蛋白上样缓冲液（含DTT，中国索莱宝，P1040）；ECL 超敏发光液（中国索莱宝，PE0010）；CLOCK 抗体（英国 Abcam，ab3517）；PER1 抗体（英国 Abcam，ab136451）；CRY1 抗体（英国 Abcam，ab54649）；BMAL1 抗体（英国Abcam，ab231793）；βactin 抗体（英国 Abcam，ab8227）。HE 染色相关试剂：改良HE 染色试剂盒（中国索莱宝，G1121）。仪器：旋转式组织脱水机（日本樱花病理仪器株式会社，4634）；组织包埋机（日本樱花病理仪器株式会社，5235）；石蜡溶蜡箱（日本樱花病理仪器株式会社，PM-401）；舒式切片机（日本樱花病理仪器株式会社，CRM-44）；双人显微镜（日本 OLYMPUS，BH-2）；Nanno Drop（美国Thermo Scientific，NDoneW）；基因扩增仪（美国MJResearch，TTC-220）；PCR仪（美国Applied Biosystems，ABI7500）；电泳仪（美国BIORAD，042BR03674）；酶 标 仪（美 国 BIO-RAD，721BR16681）。

1.2 动物分组及模型制备 用随机数字表法将大鼠分为正常对照组、模型组、盐酸氨基葡萄糖组，各8 只。模型组、盐酸氨基葡萄糖组以Hulth 法制备OA 模型，术前24 h 禁食禁水，用10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，膝关节及其周围备皮、消毒，于大鼠髌韧带做横向约5 mm 切口，充分暴露关节腔，切掉内侧半月板及内侧副韧带，刀尖向下，切断前后交叉韧带。术后以生理盐水清理伤口，以无菌纱布将周围血迹擦干后，缝合伤口。术后连续3 d以青霉素16万U局部注射，防止感染［7-8］。

1.3 干预方法 正常对照组、模型组均给予生理盐水3 mL/d灌胃；盐酸氨基葡萄糖组给予盐酸氨基葡萄糖25 mg/（kg·d）灌胃。每天1次，连续28 d。

1.4 取材 连续干预28 d，将大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）进行麻醉，麻醉后用采血针行心脏取血，每只大鼠取血10 mL 后脱颈椎处死。将造模部位的关节取出置于提前准备的器材中（注意此过程操作时膝关节不可接触鼠毛，防止RNA 酶污染）。取材完毕，将血液放入离心机内，以1 700 r/min 离心10 min（半径16 cm），分离上清液。将膝关节放置于-80 ℃冰箱中保存，用于提取RNA及蛋白质，各组取3只大鼠的膝关节进行HE染色，剩余5只用于PCR及Western blotting检测。

1.5 膝关节软骨组织病理变化观察 采用HE 染色法。将膝关节置于EDTA 中脱钙70 d，脱钙间期每天摇晃1 次脱钙的EDTA 液，每周更换1 次以充分脱钙。待膝关节周围骨头用针刺可以刺穿时进行石蜡包埋，其次进行切片、脱蜡并染色。染色结束后采用显微镜进行观察。

1.6 软骨组织破坏情况评价 采用Mankin's评分。每组取3 只脱钙后的膝关节软骨，采用Safranin O 染色，5倍物镜10倍目镜显微镜下观察软骨结构、软骨细胞数量、软骨潮线、Safranin O 染色情况，以上述四个指标综合评分作为最终Mankin's 评分。分值越高，软骨组织破坏越严重。

1.7 软 骨 组 织 中 BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1 mRNA 表达检测 采用PCR 技术。用手术刀将软骨从关节表面刮下，置于研钵内研磨，边研磨边加入液氮，研磨成粉末，转移至EP 管中。以RNA 提取试剂盒进行提取RNA，提取后的RNA以NanoDrop进行检测。用逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，配制反应体系50 μL。反应条件：94 ℃预变性 5 min；95 ℃变性1 min、65 ℃退火50 s、55 ℃延伸90 s，40 个循环。扩增引物由广州复能公司Genecopoeia合成，PER1上游引物序列5'-GACGGATTCATCTACCAGTG-3'，下游引物序列5'-GGCTTAGCGGCATTACGGTG-3'；CRY1上游引物序列5'-GACTTGGACGTTAACGGCAC-3'，下游引物序列5'-ACTTACGGTAACCGTTAGGG-3'；CLOCK 上 游 引 物 序 列 5'-ACCTAGGCTTAGCCTAACAC-3'，下游引物序列5'-ATCCCGGATAAGCTAGATAC-3'；BMAL1 上游引物序列5'-GACGTTACGTTGCACTAGAC-3'，下游引物序列 5'-GCAATGGACAAGTCGGATCG-3'；β-actin 上游引物序列5'-GAGGGAAATCGTGCGTGA-3'，下游引物序列 5'-CTGGAAGGTGGACAGTGA-3'。用 2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.8 软骨组织中 BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。取研磨成粉末的软骨，用蛋白提取试剂盒提取蛋白，提取后的蛋白使用BCA 试剂盒检测蛋白浓度，以RIPA 裂解液稀释蛋白使提取的蛋白浓度为1 μg/μL，加入蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min。配制凝胶，上样并电泳，先采用80 V 通电30 min 后转换成120 V。将分离好的条带转膜至PVDF 膜上，封闭、加抗体，其中一抗为BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1，稀释比分别为 1∶500、1∶1 000、1∶500、1∶500。二抗为β-actin 抗体，比例为1∶1 000。抗体孵育结束后显色并读取灰度值，使用Image Lab 软件读取并分析灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

1.9 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。符合正态分布的计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组软骨病理变化比较 正常对照组软骨表面光滑，潮线完整，厚度正常；模型组软骨表面不光滑，软骨变薄；盐酸氨基葡萄糖组软骨表面光滑，厚度基本正常，潮线基本完整。

2.2 各组软骨组织破坏情况比较 正常对照组、模型组、盐酸氨基葡萄糖组Mankin's 评分分别为（0.23 ± 0.17）、（11.92 ± 0.61）、（7.68 ± 0.52）分。与正常对照组比较，模型组Mankin's 评分高（P＜0.05）；与模型组比较，盐酸氨基葡萄糖组Mankin's评分低（P＜0.05）。

2.3 各组软骨组织中 BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1 mRNA表达比较 见表1。

表1 各组软骨组织中BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1 mRNA相对表达量比较（）

表1 各组软骨组织中BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1 mRNA相对表达量比较（）

注：与正常对照组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别正常对照组模型组盐酸氨基葡萄糖组CRY1 mRNA 1 1.43±0.42▲1.15±0.31△BMAL1 mRNA 1 0.53±0.26▲0.83±0.63△CLOCK mRNA 1 0.51±0.32▲0.94±0.56△PER1 mRNA 1 1.55±0.46▲1.29±0.61△

2.4 各组软骨组织中 BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1蛋白表达比较 见表2。

表2 各组软骨组织中BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1蛋白相对表达量比较（）

表2 各组软骨组织中BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1蛋白相对表达量比较（）

注：与正常对照组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别正常对照组模型组盐酸氨基葡萄糖组CRY1蛋白1 1.46±0.22▲1.05±0.22△BMAL1蛋白1 0.64±0.15▲0.79±0.23△CLOCK蛋白1 0.61±0.32▲1.12±0.36△PER1蛋白1 1.65±0.43▲1.19±0.31△

3 讨论

OA作为一种常见的关节退行性疾病，严重影响患者的生活质量。研究OA 与软骨细胞生物钟的关系，可从生物钟的方向探索OA 可能的发病机制。本研究采用Hulth 法制作OA 模型。关节软骨由软骨基质和软骨细胞组成，软骨表面的局灶损伤是OA发生的开始，进而出现软骨基质代谢紊乱，最后发展成更大范围的软骨破坏。本研究结果显示，OA大鼠关节软骨表面不光滑，HE 染色见软骨变薄，潮线不完整，Mankin's 评分较高，表明存在明显的骨破坏，此表现与OA 的病理表现一致，证明Hulth 法可成功复制OA 模型。盐酸氨基葡萄糖干预后OA 大鼠关节软骨表面变光滑，潮线完整，Mankin's 评分降低，表明盐酸氨基葡萄糖对OA 大鼠有治疗作用，可以作为本实验的阳性药物。

本研究PCR 检测结果显示，模型组软骨组织BMAL1、CLOCK 基因表达低，PER1、CRY1 基因表达高；盐酸氨基葡萄糖干预后，BMAL1、CLOCK 基因表达量上升，PER1、CRY1 基因表达量下降。Western blotting 检测结果与PCR 结果一致。这与相关研究结果一致，即OA 患者软骨细胞中存在生物钟基因及蛋白表达紊乱，其中BMAL1 蛋白的表达明显降低［9-11］。另外本研究还发现，除BMAL1 蛋白表达降低外，CLOCK 蛋白表达量也呈降低趋势，而PER1、CRY1 蛋白表达量呈升高趋势。但由于目前对OA软骨细胞生物钟的相关研究较少，并不能明确BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1 四种基因及蛋白在OA中的主要作用。

哺乳动物体内存在着两个生物钟环路［12-14］，该环路主要依靠四种蛋白的调控，分别是BMAL1、CLOCK 和 PER1、CRY1 蛋白，前两种对生物钟的调控起激活作用，后两种起抑制作用［15-16］。结合本研究结果可以推测，OA大鼠软骨细胞中起激活作用的BMAL1、CLOCK 表达受到抑制，而起抑制作用的PER1、CRY1 表达被激活，这导致了“休息时软骨细胞的修复”以及“运动时软骨细胞的磨损”之间的平衡被打破，在休息时使软骨不能及时得到修复，进而引发OA。由此猜想，可将时间医学纳入OA 的治疗理念中，通过修复OA 软骨细胞生物钟基因及蛋白的表达，维持好“休息时软骨细胞的修复”以及“运动时软骨细胞的磨损”之间的动态平衡。

综上所述，OA 大鼠存在软骨细胞生物钟紊乱，其中对生物钟起激活作用的BMAL1、CLOCK基因及蛋白表达下降，起抑制作用的PER1、CRY1 基因及蛋白表达上升。本研究探索了OA 的发病机制，为OA的临床治疗提供新的思路与方向。