黄芩苷对急性高眼压小鼠视网膜损伤的治疗作用

高雪松，王全，张钊，孙瑞强

天津市眼科医院麻醉科，天津300020

青光眼是一种对视神经及视觉功能产生损伤的疾病，其主要特征为视网膜神经节细胞（RGC）发生不可逆性死亡或视野缺损［1］。临床认为青光眼的发病机制与机械压迫、缺血损伤、氧化应激及神经炎症反应等有关，但针对青光眼发病机制的有效治疗手段却研究较少［2-3］。因此，如何早期对青光眼患者进行干预，阻止RGC 进一步受损，成为目前临床上研究的难题。黄芩苷是从中药黄芩中提取的一种黄酮类化合物，能通过对Toll 样受体4 信号通路的调节减轻神经系统神经炎症反应［4］。目前有关黄芩苷是否对急性高眼压视神经损伤有治疗作用的研究较少［5］。因此，2021 年 2 月—7 月本研究观察黄芩苷对急性高眼压小鼠视网膜损伤的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 6～8 周C57BL/6 小鼠100只，雌雄各半，体质量 180～225（210 ± 20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证为［SCXK（京）2016-0008］，动物饲养室温度（21 ±2）℃，相对湿度（55 ± 1）%，光照/黑暗周期为12 h，实验开始前均以普通饲料饲养，符合“眼与视觉研究协会动物使用声明”中的相关规定［5］。黄芩苷购自荆州市宏达生物科技股份有限公司，HE染色试剂盒购自上海一研生物科技有限公司，兔抗鼠诱导性一氧化氮合酶（iNOS）购自美国CST 公司，免疫鼠白细胞介素1β（IL-1β）抗体购自上海安研商贸有限公司，免疫鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）购自上海信帆生物科技有限公司，小鼠IL-1β 酶联免疫吸附试验试剂盒购自中国广州Elabscience 公司，实时荧光定量PCR试剂盒、反转录试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，Tonolab手持眼压计购自芬兰Icare公司。

1.2 动物分组、模型构建及药物干预 用随机数字表法将小鼠分为正常对照组、高眼压组、黄芩苷25 mg/kg+高眼压组、黄芩苷50 mg/kg+高眼压组、黄芩苷75 mg/kg+高眼压组，每组20 只。其中正常对照组正常饲养，其他各组通过前房灌注平衡盐溶液建立急性高眼压模型，方法：经腹腔麻醉后对小鼠眼球表面进行麻醉及散瞳。使用一次性无菌输液器连接30 G 胰岛素针头及生理盐水溶液以形成前房灌注装置，对前房进行穿刺，维持灌注高度为1 m，用Tonolab眼压计测量小鼠眼压，保证眼压60 mmHg左右，使前房维持50 min 的水密状态。且前房灌注前30 min，黄芩苷各组经尾静脉分别注射25、50、75 mg/kg 黄芩苷，药物浓度选择参考相关文献［6］；正常对照组及高眼压组经尾静脉注射等量生理盐水。

1.3 视网膜厚度测算 采用HE 染色法。造模1、3、5、7 d 时，各组每日分别取5 只大鼠以10%水合氯醛进行麻醉并断颈处死，取左眼视网膜组织，制作石蜡切片后用HE 进行染色，在Zeiss 倒置显微镜下采集视网膜图片，用ImageJ 软件对距神经中心1 mm 处内界膜至外界膜的视网膜全层厚度进行测量。

1.4 视网膜组织中IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。造模7 d后，取各组右眼视网膜组织分成两部分保存于液氮中，其中一部分制备组织匀浆并提取总RNA，测定浓度及纯度，以RNA 为模板行逆转录反应，将所得cDNA 进行 qRT-PCR 反应。反应体系 20 μL：ULtra-SYBR mixture 10 μL、模板cDNA 2 μL、上下游引物各2.0 μL、去离子纯化水4 μL。反应条件：95 ℃预变性 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 个循环。以U6为内参，用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列由赛默飞世尔科技（中国）有限公司设计并合成。IL-1β 正向引物序列：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，反向引物序列：5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'；TNF-α 正向引物 序 列 ：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物序列：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'；iNOS 正向引物序列：5'-AAGAACCAGTACGTCAGTATCGG-3'，反向引物序列：5'-CACAAACGAGACCAGCGAGT-3'；β -actin 正 向 引 物 序 列 ：5'-GCAGAAGTGCGAAGAGGAGG-3'，反向引物序列：GCTTGATGGAGTTGTCGGTGTA-3'。

1.5 视网膜组织中IL-1β、TNF-α、iNOS蛋白表达检测 采用Westen blotting 法。将剩余部分右眼视网膜组织制备组织匀浆，冰上裂解，依据蛋白提取试剂盒提取总蛋白，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚偏二氟乙烯膜转膜，5%牛血清白蛋白封闭，孵小鼠一抗IL-1β、TNF-α、iNOS 及内参β-actin，稀释比例均为1∶500，4 ℃过夜，清洗，孵育辣根过氧化物酶标记的二抗，曝光显影，用ImageJ 软件分析蛋白条带，目的基因相对表达量=目的蛋白条带灰度值/β-actin 蛋白条带灰度值。

1.6 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。计量资料符合正态分布以表示，多组比较采用方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间点视网膜全层厚度比较 见表1。

表1 各组不同时间点视网膜全层厚度比较（n=5，）

表1 各组不同时间点视网膜全层厚度比较（n=5，）

注：与正常对照组同时间点比较，aP＜0.05；与高眼压组同时间点比较，bP＜0.05；与黄芩苷25 mg/kg+高眼压组同时间点比较，cP＜0.05；与黄芩苷50 mg/kg+高眼压组同时间点比较，dP＜0.05。与同组造模1 d比较，eP＜0.05；与同组造模3 d比较，fP＜0.05；与同组造模5 d比较，gP＜0.05。

造模7 d 131.22±25.18 389.96±58.50aefg 201.73±30.26abefg 181.25±27.19abcefg 157.11±23.58abcdefg组别视网膜全层厚度（μm）造模3 d 130.06±24.33 321.16±48.18ae 245.76±36.87abe 231.85±35.78abce 210.16±32.55abcde造模1 d 132.16±24.33 295.89±45.03a 262.38±39.36ab 250.55±33.23abc 233.03±27.45abcd造模5 d 132.13±24.32 359.69±55.50aef 222.73±33.41abef 206.79±31.05abcef 183.05±27.45abcdef正常对照组高眼压组黄芩苷25 mg/kg+高眼压组黄芩苷50 mg/kg+高眼压组黄芩苷75 mg/kg+高眼压组

2.2 各组视网膜组织中IL-1β、TNF-α 及iNOS 表达比较 见表2。

表2 各组视网膜组织中IL-1β、TNF-α及iNOS表达比较（n=5，）

表2 各组视网膜组织中IL-1β、TNF-α及iNOS表达比较（n=5，）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与高眼压组比较，bP＜0.05；与黄芩苷25 mg/kg+高眼压组比较，cP＜0.05；与黄芩苷50 mg/kg+高眼压组比较，dP＜0.05。

蛋白0.20±0.03 1.16±0.18a 0.83±0.13ab 0.66±0.09abc 0.40±0.06abcd组别正常对照组高眼压组黄芩苷25 mg/kg+高眼压组黄芩苷50 mg/kg+高眼压组黄芩苷75 mg/kg+高眼压组IL-1β mRNA 1.00±0.15 1.89±0.29a 1.75±0.28ab 1.58±0.25abc 1.26±0.19abcd蛋白0.19±0.03 0.98±0.15a 0.72±0.11ab 0.51±0.08abc 0.35±0.06abcd TNF-α mRNA 1.00±0.16 1.77±0.27a 1.53±0.23ab 1.40±0.22abc 1.18±0.18abcd蛋白0.23±0.05 0.97±0.15a 0.79±0.12ab 0.62±0.09abc 0.45±0.07abcd iNOS mRNA 1.00±0.15 1.92±0.29a 1.80±0.28ab 1.61±0.25abc 1.37±0.21abcd

3 讨论

青光眼是一种不可逆致盲性眼病，其病理基础是RGC 发生不可逆性死亡。常通过制备前房灌注模型以模拟急性青光眼视神经损伤，该模型所产生的压力机械性损伤情况与青光眼急性发作的疾病进程具有较好的一致性［7-8］。评估视网膜的病理形态学能进一步了解干预因素对视网膜损伤的作用［9］。黄芩可常用于治疗肝胆疾病、炎症反应性疾病，从黄芩苷中所提取分离的黄酮类化合物具有抗炎、神经保护、抗氧化及对肿瘤生长产生抑制作用。但目前临床仍缺乏具有明确视神经保护功效类药物，所以在本研究中并无阳性对照组。

视网膜是眼睛里一层菲薄而透明的组织，对于完成视觉功能非常重要，视网膜厚度增加往往说明视网膜发生病变。本研究结果显示，与正常对照组比较，高眼压组各时间点视网膜全层厚度均升高，具有时间依赖性，而当以不同浓度黄芩苷药物进行干预后，小鼠各时间点视网膜全层厚度均一定程度降低，呈时间及剂量依赖性。说明黄芩苷可能对高眼压小鼠视网膜损伤具有一定保护作用。近年来对神经炎症反应的研究越来越重视，病理情况下，神经小胶质细胞被激活后快速增殖，释放大量的神经毒性因子及炎症反应因子等，介导脑神经元的损伤［10］。IL-1β、TNF-α、iNOS 均是常见致炎因子。本研究发现，与正常对照组比较，高眼压组小鼠视网膜组织中炎症因子IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA 及其蛋白表达均升高；当以不同浓度黄芩苷药物进行干预后，小鼠视网膜组织中炎症因子IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA及其蛋白表达均一定程度降低，呈剂量依赖性。说明黄芩苷能有效减轻小鼠视网膜组织中炎症因子的表达、释放，进而减轻炎症反应。

由于本研究采用的是预处理的方式进行干预，这与临床中先发病后治疗的实际情况可能不相符。但有学者在缺血缺氧性脑损伤疾病的动物研究中发现，黄芩苷与对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤具有保护作用的地塞米松具有相似药理作用［11］。谭丽丽等［12］研究显示，缺血预处理联合黄芩苷预处理对大鼠脑缺血再灌注半暗带细胞凋亡具有抑制作用，从而发挥脑保护作用。基于以上文献，本研究选择了以黄芩苷预处理的方式进行干预。

综上所述，用黄芩苷能减轻急性高眼压小鼠视网膜炎症反应，进而保护损伤的视网膜，可为黄芩苷在临床急性高眼压中的治疗提供理论依据。然而本研究并未能明确黄芩苷对急性高眼压视网膜损伤发挥保护作用的具体机制，后期应进行深入研究。