红参提取物通过抑制凋亡减轻H2O2 诱导大鼠心肌细胞氧化损伤作用研究*#

张雨曦* 庄倩 李玉倩 石林 章卓 姜鲜

（1. 西南医科大学药学院2019 级研究生，四川 泸州 646000；2. 西南医科大学药学院药理教研室，四川泸州 646000；3. 泸州市人民医院麻醉科，四川 泸州 646000）

心血管疾病是目前病死率较高的疾病[1]，发病机制与心肌细胞损伤有关，其中心肌细胞的氧化损伤是心血管疾病发生发展的重要因素，可大大增加患者的死亡风险[2]。近年来研究显示，氧化损伤可导致心肌细胞的正常结构和生理功能受损，进一步诱发心肌细胞凋亡，并最终演变成心力衰竭[3]。因此，减轻心肌细胞的氧化损伤对缓解心血管疾病尤为重要。

红参提取物（Red ginseng extract，Rge）包含人参皂苷类、有机酸类、糖类等多种活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、增强心功能等多种药理作用，尤其在免疫系统疾病、心血管系统疾病中具有明显的抗氧化作用[4-10]。但是，目前采用细胞模型对Rge 减轻心肌氧化损伤的研究较少，因此本研究旨在研究Rge 减轻过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）致H9c2 心肌细胞氧化损伤的作用及相关机制，并为Rge 防治心肌氧化损伤提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

大鼠心肌细胞（H9c2）株购自中国科学院上海细胞库，用含10% FBS 和1%青-链霉素的DMEM/H 培养基在37℃、5%CO2孵箱中培养，每两天进行换液和传代。

1.1.2 药物与试剂

红参提取物（含量大于98%，西安维珍生物科技有限公司，中国）；过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）（上海麦克林生化科技有限公司，中国）；DMEM/H 培养基（Gibco，美国）；FBS（Gibco，美国）；青-链霉素溶液（北京罗比生物科技有限公司，中国）；MTT（北京索莱宝科技有限公司， 中国）； 乳酸脱氢酶（ Lactate dehydrogenase，LDH）（南京建成生物工程研究所，中国）；Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-actin 抗体（Proteintech，美国）；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（上海碧云天生物技术有限公司，中国）；PAGE快速制备试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司，中国）；双敏化学发光试剂（Affinity，美国）；蛋白Marker（北京索莱宝科技有限公司，中国）；5× SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，JC-1 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，中国）。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法筛选H2O2最优造模浓度

选对数生长期的H9c2 心肌细胞（7×103个·孔-1）接种于96 孔板中，设置对照组和模型组，每组6 个复孔，贴壁24 h 后给药。对照组常规培养；模型组用不同浓度（0.9 mg·kg-1、1.8 mg·kg-1、3.6 mg·kg-1、7.2 mg·kg-1、14.4 mg·kg-1）H2O2溶液处理6 h 后，弃上清，以含10% MTT 的培养液孵育4 h 后，每孔换用DMSO 100 μL，摇床震荡5 min，测定490 nm 波长处吸光度值（OD）。细胞存活率=模型组OD /对照组OD×100%。实验重复3 次。

1.2.2 Rge 对H9c2 心肌细胞增殖的影响

选对数生长期的H9c2 心肌细胞（7×103个·孔-1）接种于96 孔板中，设置对照组和Rge 组，每组6 个复孔，贴壁24 h 后给药。对照组常规培养；Rge 组用不同浓度（50、100、200、400、800、1600 mg·kg-1）Rge 溶液培养24、48、72 h。后续实验步骤参照1.2.1。实验重复3 次。

1.2.3 Rge 对H2O2致H9c2 心肌细胞氧化损伤的作用

对数生长期H9c2 心肌细胞（7×103个·孔-1）接种于96 孔板中，设置对照组，模型组，Rge 低、中、高浓度组，每组6 个复孔，贴壁24 h 后给药。对照组常规培养；模型组用9 mg·kg-1的H2O2溶液处理6 h；Rge 低、中、高浓度组分别用200 mg·kg-1、400 mg·kg-1和800 mg·kg-1Rge 溶液处理24 h 后，9 mg·kg-1H2O2溶液继续处理6 h。后续实验步骤参照1.2.1。实验重复3 次。

1.2.4 化学法检测LDH 释放量

选对数生长期的H9c2 心肌细胞（1×104个·孔-1）接种于24 孔板中，细胞按1.2.3 进行分组和给药，每组3 个复孔。，吸取各组细胞培养上清于1.5 mL EP 管，4℃条件下，以3000 g 离心10 min。结束后，取上清液，按试剂盒说明书检测。

1.2.5 JC-1 法凋亡染色

选对数生长期的H9c2 心肌细胞（5×104个·孔-1）接种于6 孔板中，设置对照组，模型组，CCCP 组（阳性对照），Rge 低、中、高浓度组，每组3 个复孔，贴壁24h 后给药。对照组常规培养；模型组和CCCP 组分别用9 mg·kg-1的H2O2溶液和2.05 mg·kg-1的CCCP 溶液处理6 h；Rge 低、中、高浓度组分别用200 mg·kg-1、400 mg·kg-1和800 mg·kg-1的Rge 溶液处理24 h 后，9 mg·kg-1的H2O2溶液继续处理6 h。处理完毕后，PBS 清洗两次，JC-1 染色工作液与完全培养基1：1 混合，37 ℃作用20 min 后，除去上清，用1×JC-1 缓冲液清洗两次，最后加入2 mL PBS，荧光显微镜下观察染色情况并进行拍照。

1.2.6 Western blot 法检测细胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表达

选对数生长期的H9c2 心肌细胞（5×105个·孔-1）接种于6 孔板中，细胞按1.2.3 进行分组和给药，每组3 个复孔。用预冷的PBS 洗三次，每孔以80μL 裂解液（PMSF：PⅠPA=1：100）裂解细胞，置于冰上0.5h；4℃条件下，以12000 g 离心10 min；结束后，回收上清，BCA 试剂盒测定各组细胞蛋白浓度；将各组蛋白样品与5×上样缓冲液按1：4 混合后，金属浴（95℃）煮蛋白10 min；PAGE凝胶电泳分离目标蛋白；湿法转膜；用封闭液室温封闭40 min；TBST 溶液快速洗膜3 次，每次10 min；结束后，分别加入Caspase-3、Bax、Bcl-2 抗体在4 ℃孵育过夜；次日再用TBST 溶液快速洗膜3 次，每次10 min；然后加入二抗，室温摇床慢速孵育1 h；TBST 溶液洗膜3 次，每次10 min；最后加入显影液，用凝胶成像仪采集图像。

1.2.7 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0 进行统计学分析并作图，数据结果均以均数±标准（±SD）表示，组间的差异以单因素方差分析进行比较。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Rge 对H2O2 损伤的H9c2 心肌细胞活力的影响

利用MTT 法测定H2O2致H9c2 心肌细胞氧化损伤的ⅠC50，见图1A，与对照组相比，模型组的细胞活力呈现剂量依赖性降低（P＜0.05 或P＜0.001），其ⅠC50为9.16 mg·kg-1，故后续试验选择9 mg·kg-1H2O2作为H9c2 心肌细胞氧化损伤的造模浓度。同时，利用MTT 法检测不同浓度Rge与H9c2 心肌细胞作用24、48、72 h 的影响，见图1B，与对照组相比，50、100、200、400、800 mg·kg-1Rge 作用H9c2 心肌细胞24、48、72 h 时，细胞的活力没有任何影响（P＞0.05），然而Rge 浓度为1600 mg·kg-1时，细胞的活力显著被抑制（P＜0.001），故后续实验采用200、400、800 mg·kg-1Rge 分别作为低、中和高浓度用于预处理H9c2心肌细胞24 h。

图1 MTT 法评价Rge 和H2O2 对细胞活力的影响

最后，利用MTT 法评价Rge 对抗H2O2所致的氧化损伤，见图1C，与对照组相比，模型组的细胞活力降至50.09%（P＜0.05），表明成功建立氧化损伤模型，与模型组相比，Rge 低、中、高浓度组的细胞活力分别提升了9.21%、25.34% 和36.25%，表明Rge 呈剂量依赖性降低H2O2所致的氧化损伤。

2.2 Rge 对H2O2 诱导H9c2 心肌细胞LDH 的影响

如图2 所示，对照组LDH 释放量为13.45%，模型组中LDH 释放量升高至70.12%，Rge 低、中、高浓度组的LDH 释放量分别为61.81%、46.12%和23.18%。与模型组相比，Rge 低、中、高浓度组LDH 的释放量呈现剂量依赖性降低，表明Rge能够抑制LDH 的释放量抵抗H2O2造成的氧化应激损害从而减轻细胞膜的破坏。

图2 Rge 对H2O2 诱导H9c2 心肌细胞LDH 的影响

2.3 Rge 对H2O2 诱导H9c2 心肌细胞凋亡的影响

与对照组相比，模型组和CCCP 组产生明显绿色荧光，红色荧光相对减弱，表明成功建立H9c2 心肌细胞氧化损伤模型。与模型组和CCCP组相比，Rge 低、中、高浓度组绿色荧光呈剂量依赖性降低，表明Rge 可以控制线粒体膜电位的下降，抑制H9c2 心肌细胞的凋亡，见图3。

图3 JC-1 法评价Rge 对H2O2 诱导H9c2 心肌细胞凋亡的影响（×200）

另外，Western blot结果显示：与对照组相比，模型组中Caspase-3 蛋白表达水平明显增加，达到2.2 倍（P＜0.01）；与模型组相比，Rge 低、中、高浓度组中Caspase-3 和Bax蛋白表达水平随着Rge浓度增加依次降低了51.29%、78.26%、78.75% 和24.41%、34.13%、79.47%，而Bcl-2 蛋白表达水平依次增加了12.97%、24.46%和24.59%，详细见图4。

图4 Western blot 法评价Rge 对H2O2 诱导H9c2 细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白的表达

3 讨论

氧化应激反应是引发心肌细胞损伤的主要病理机制之一[11]。若机体长期处于氧化损伤状态会造成心肌组织细胞大量死亡，从而引发心力衰竭等严重疾病。H2O2能参与体内较多重要的胞内反应，如转录因子的激活，但是当H2O2在细胞内聚集过多时，则加剧氧化应激反应，造成心肌细胞凋亡，为了尽可能的重现临床上氧化损伤心肌病变的进程，我们利用H2O2构建体外氧化损伤模型[12-14]。在评价Rge 对H9c2 心肌细胞活力影响的实验中发现，Rge 能以剂量依赖性的方式提高H9c2 心肌细胞的细胞活力，从而抵抗H2O2导致的氧化损伤。LDH 释放量可是评价细胞活力和细胞膜完整性的关键指标[15,16]。处于氧化损伤状态的心肌细胞，其细胞膜完整性受损，导致LDH 大量释放，使细胞损伤进一步加重。我们发现Rge能够抑制LDH 的释放，表明Rge 能够保护细胞膜的完整性，减轻细胞损伤。过激的氧化损伤可导致细胞凋亡[17,18]。线粒体膜电位的下降是细胞处于凋亡早期的标志之一。JC-1 试剂盒能通过荧光颜色的改变判断线粒体膜电位的变化，从而衡量细胞凋亡的状态。Rge 低、中、高浓度组线粒体基质内的红色荧光随着Rge浓度的增加而逐渐明亮，并且胞质内的绿色荧光逐渐消失，因此，Rge 能抑制线粒体膜电位的下降，减轻H9c2 心肌细胞的氧化损伤，阻断H9c2心肌细胞的凋亡。细胞凋亡是H9c2 心肌细胞氧化损伤的重要过程，研究Rge 对凋亡的影响可反应Rge 保护心肌细胞氧化损伤的部分机制。Caspase-3 是凋亡中重要的枢纽蛋白，能和Bax 分别启动和调控细胞的凋亡，但该过程可被调控凋亡途径的抗凋亡蛋白Bcl-2 阻断[19,20]。我们发现，Rge能下调Caspase-3、Bax蛋白的表达和上调Bcl-2 蛋白的表达。因此，Rge 可能通过阻断凋亡途径，增强H9c2 心肌细胞对氧化损害的抵抗作用。

综上，Rge 可能通过促进Bcl-2 蛋白表达并且阻断Caspase-3 和Bax 蛋白表达，从而减轻H2O2致H9c2 心肌细胞的氧化损害，从而增强H9c2 心肌细胞抵抗不利因素的能力，但是否与其他作用机制有关待需进一步研究。