改变血清三酰甘油测定方法的可行性研究

郝世奇 徐翠玲 张柳 王闽楠 刘继勇

血清三酰甘油是3分子长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，为所有脂蛋白中的三酰甘油总和，常作为临床上一项重要的血脂常规测定指标。同时血浆三酰甘油升高可作为冠心病的一项独立危险因素[1]。尤为重要的是当三酰甘油>11.3 mmol/L时，患者罹患急性胰腺炎的危险性极大增加[2]。目前对于超出线性范围的三酰甘油检测标本，均采用稀释复查的方法进行检测，但通过改变检测测定时间点，扩大三酰甘油的线性范围，提高三酰甘油测定的准确性的研究笔者所见极少。本研究通过改进三酰甘油在AU-5800生化仪上时间监测点，扩大测定的线性范围，提高检测结果的准确性和时效性，避免稀释产生的偶然误差，为患者能够获得及时、准确的诊疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2018年6～8月门诊和住院就诊患者脂类测定空腹肘部静脉血的血清三酰甘油检测标本45例(其中超出线性范围标本12例，未超出线性范围标本33例)，原参数设定测定点的检测结果作为对照组，参数测定点设定为0～1 min、0～2 min、0～3 min、0～4 min的45例标本的各测定点的检测结果作为试验组，分别为1、2、3、4试验组。

1.2 方法 45例检测标本均来源于来我院就诊的门诊和住院患者检测血脂项目时采集的空腹肘静脉血。以4 000 r/min转速离心10 min，分离获取血清，并在-70℃条件下保存，且开展三酰甘油检测。检测主要仪器及试剂：(1)采用美国BEKMAN COULTER AU5800全自动生化分析仪检测；(2)试剂采用上海科华生物工程股份有限公司生产的三酰甘油试剂盒(甘油磷酸氧化酶法)进行检测。并在各项实验开始前先进行质控检测，所用质控为伯乐实验有限公司生产的生化多项质控物，水平2(批号：26421)、水平3(批号：26422)2个浓度水平，所有质控结果在控。

2 结果

2.1 5组三酰甘油测量结果比较 采用单因素方差分析进行多组间比较，组间平方和=25.326，均方=6.322；组内平方和=12430.717，均方=56.503，F=0.112，P=0.978，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 5组三酰甘油测量结果

2.2 试验组与对照组间三酰甘油测量结果比较 Dunnett-t(双侧)检验结果比较，将对照组作为控制组，4组试验组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。比较无显著性差异2组间进一步比较均值标准差。见表2。

表2 试验组与对照组组间三酰甘油测量结果比较Dunnet-t(双侧)

2.2.1 从表2数据分析，试验1组(0～1 min)、试验2组(0～2 min)、试验3组(0～3 min)、试验4组(0～4 min)两点终点法所得显著性水平分别为0.934、0.984、1.000、1.000，显著性水平越高，说明试验组与对照组差异越小，所以试验组3组和4组显著性水平优于其他2组；试验1组(0～1 min)、试验2组(0～2 min)、试验3组(0～3 min)、试验4组(0～4 min)两点终点法所得均值标准差分别为-0.96330、-0.65800、0.04111、-0.1966，均值标准差越小，说明试验组与对照组越接近，所以试验3组明显优于其他3组。经过Dunnett-t检验分析，选取试验3组(0～3 min)为最佳测定终点，将三酰甘油的测定终点提前到3 min，所得到的检测结果与稀释标本所得到的结果无显著性差异，即为三酰甘油的检测结果。

2.2.2 对更改后的试验方法进行线性范围测定，选取一个低浓度和一个超出正常检测范围的高浓度标本，按照4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4，五种配比方式混匀，上机进行检测，测量到通过更改试验终点可将三酰甘油的检测范围扩大到22 mmol/L。较之前方法极大提高了标本的检测范围，避免了假阴性结果的产生。

2.2.3 原参数设定测定超出线性范围标本三酰甘油反应曲线图及标本稀释后测量反应曲线分析，在超出线性范围标本测量的反应曲线中可以观察到在测量点16点时反应曲线出现下降现象，仪器测定对于超出检测范围的标本反应曲线终点OD值远低于样本真实结果，仪器所检测出的结果为11.2 mmol/L。将超出线性范围标本进行3倍稀释，稀释后检测反应曲线图显示，反应曲线上升后呈平缓曲线，符合线性范围内测量反应曲线模式，稀释后仪器所检测出的结果为21.8 mmol/L。见图1、2。

图1 超出线性范围标本三酰甘油测量反应曲线图

2.2.4 参数设定将三酰甘油的测定终点提前到3 min时(试验3组)的反应曲线图分析，从仪器监测反应曲线图显示，反应曲线上升后呈平缓曲线，符合线性范围内测量反应曲线模式，仪器所检测出的结果为21.3 mmol/L。见图3。

图2 超线性范围标本稀释3倍三酰甘油测量反应曲线图

图3 试验3组三酰甘油测量反应曲线图

2.2.5 相关性 对照组与4组试验组均高度相关，4组试验组与对照组见回归方程依次为Y1=1.200X-0.4259(r=0.9702)；Y2=1.142X-0.3379(r=0.9962)；Y3=0.9843X-0.1118(r=0.9993)；Y4=1.0249X-0.1339(r=0.9993)。

3 讨论

两点终点法是取反应尚未开始时读取一个点的吸光度，待反应达到终点时再取第二点的吸光度。用第二点吸光度减去第一点吸光度的差值来计算结果，主要用于扣除试剂和样品空白，保证结果的准确性，一般用于双试剂。 在AU5800生化全自动生化分析仪的终点检测法两点检测(自身空白对照方法)中是用于要求空白调零的终点检测法。应减去加注试剂2之前的OD值以作为空白管。从加入试剂2之后所测得的数值中减去空白管的OD值以得到不受血清的浊度和颜色影响的数据。此法的OD值如下所示：K2=[R1.V/(R1.V+R2.V+S.V)];K3=[(R1.V+S.V)/(R1.V+R2.V+S.V)];反应物OD值=(Px-K2×P0)-(K3×Pz-K2×P0)，计算结果即为反应物OD值。三酰甘油反应原理基于Trinder反应，在以往研究报道中，两点终点法优于一点终点法的检测[3,4]。本试验研究中，则依据此原理进行测定点的参数设定，通过Dunnett-t(双侧)检验统计和相关性综合分析，试验选取测定点0～3 min时的最佳参数设定点。

高三酰甘油血症是引起相关性急性胰腺炎的常见病因，重症患者可发生多器官功能衰竭甚至死亡[5-8]。急性胰腺炎是多种病因导致的胰腺组织自身消化引起的胰腺水肿、出血及坏死等炎性损伤，有研究表明高三酰甘油血症患者有12%～38%发生急性胰腺炎[9]。高三酰甘油血症相关性急性胰腺炎由Klatskin于1952年首次报道，临床实践发现，该病具有病情进展快、并发症多、复发率高、病死率高等特点[10,11]。高三酰甘油血症相关性急性胰腺炎目前在临床上比较常见，有资料显示，其发病率约占急性胰腺炎的10%[12,13]，是临床医生不容忽视的一类疾病。因此及时检测血脂变化对高三酰甘油血症相关性急性胰腺炎具有重要的临床意义。

同时，血液血脂水平是临床密切关注的心脑血管疾病监测指标之一。心脑血管疾病是指若干种危险因素所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。尽管在实施生活方式改变和预防药物治疗方面取得了进展，但心脑血管疾病仍然是威胁人类健康并导致死亡的主要原因之一[14]。而血脂异常是冠心病众多危险因素中的重要因素之一。研究证实冠心病的危险因素主要包括高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低与总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高[15]。研究显示，餐后血脂可全面反映糖尿病患者的血脂状况、对其心血管风险预测具有重要价值[16]。由此可见，血清三酰甘油与临床一些急危重疾病密切相关，血清三酰甘油检验结果快速准确的发送，对相关疾病的治疗和预后起着至关重要的作用。

我院血清三酰甘油检测仪器为AU-5800全自动生化分析仪，检测试剂为上海科华三酰甘油试剂盒，三酰甘油试剂盒的线性检测范围为0～11.3 mmol/L，检测方法为终点法。通过对于超出线性范围的血清三酰甘油标本的反应监测曲线分析发现，反应在未到达终点时反应曲线已经出现开始下落的现象，这一点在本试验研究中已有证实。原因是由于全自动生化分析仪的反应杯口径通常较小，反应体系与空气接触面积小，所以氧气向反应体系中扩散的速度慢，反应体系中三酰甘油浓度过高时，溶解氧被耗尽，反应近于停止，醌亚胺具有氧化性，导致醌亚胺浓度下降，反应曲线表现出异常降支，测定结果出现“倒钩”现象[17]。本研究AU5800全自动生化分析仪所用比色杯是由光程长度为5 mm的光学玻璃制成的，最大反应体积为287 μl，由于三酰甘油测定试剂用量少，比色杯口径小，导致浓度过高的三酰甘油标本更易出现“倒钩”现象。因此实际结果已超线性范围的标本的测定结果明显要低于标本真实结果，超出线性范围的检测结果如被疏忽发出，必定造成假阴性的结果，延误患者诊疗。同时我们还发现“倒钩”现象存在于大多数氧化酶法测定实验比如葡萄糖测定(葡萄糖氧化酶法)等中，一旦检测标本真实结果超出检测上限，都会发生“倒钩”现象，对于其他氧化酶法测定是否也能像本实验一样通过调节测定终点来扩大检测范围，还有待研究，需要通过进一步进行实验分析去证实。

对于超出线性范围的三酰甘油标本，可以通过手工稀释标本或者在AU5800上设置自动复查参数来实现，但是这将会使仪器整体测定速度下降，也会增加检测次数。本研究将三酰甘油终点法改为两点终点法，本质是通过改变系统测定参数，将三酰甘油测定终点提前，既快速准确的得出结果，又扩大三酰甘油测定的线性范围。避免了手工稀释造成的偶然误差又减少了自动复查的次数，同时对于极高浓度的标本也不会被当成假阴性结果发出，对患者造成误诊。在保证试验正确度的前提下，既加快检验速度，又节约资源。对于>22 mmol/L的极高浓度的标本，仍需手工稀释或仪器自动复查得出结果。

综上所述，我们发现类似三酰甘油、血糖等应用氧化酶法测定的项目，对于真实浓度水平超出线性检测范围的检测数据很容易出现假阴性结果，在我们日常工作中极易出现漏检现象，因此对于此类项目发放结果时，应多结合反应曲线进行综合分析，避免出现假阴性结果的而导致漏检问题。