牛大力叶中总多糖、总黄酮、总皂苷含量及其抗氧化活性的研究

莫宏辉，邓国卫，李 珊

（1.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007；2.湖南中和制药有限公司，长沙 410205）

牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤（Millet⁃tia speciosaChamp.），以根入药，属于药食同源品种之一，具有补虚润肺、强筋活络等功效，中医临床上常用于治疗腰肌劳损、风湿性关节炎、肺虚咳嗽、慢性支气管炎等［1］。据已有的研究报道发现，牛大力中存在多糖类、三萜皂苷类、黄酮类、生物碱类、微量元素、氨基酸等多种不同类型成分［2，3］，具有提高免疫、抗疲劳、抗应激、保肝、祛痰、止咳、平喘、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用［4，5］。

牛大力叶是来源于美丽崖豆藤的叶子，全年可采收，目前有关牛大力叶的研究报道主要集中于专利方面，如“一种牛大力叶或/和花保健茶及其加工方法”“一种牛大力叶茶及其制备方法”等［6，7］，而对其化学成分、药理活性、提取纯化工艺等则未见报道。目前，国家卫生健康委员会已批准牛大力作为新食品原料，但在促进该产业发展的同时也引发了原材料价格上涨，如能对其叶子资源进行开发利用，将有望借鉴于枇杷叶、三七花、三七茎叶、白木香叶等作为地方特色食品成为新食品原料［8］。因此，本研究对牛大力叶中的总多糖、总黄酮、总皂苷等成分含量进行测定，同时对其体外抗氧化活性进行评价，以期为其资源的开发利用提供试验依据，也进一步填补相关研究的空白。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试药D-无水葡萄糖对照品（含量98%，CAS号：50-99-7，成都埃法生物科技有限公司）；芦丁对照品（含量98 %，CAS 号：153-18-4，成都埃法生物科技有限公司）；人参皂苷Rb1 对照品（含量98%，CAS 号：41753-43-9，成都埃法生物科技有限公司）；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、过硫酸钾、硫酸亚铁、过氧化氢、香草醛、水杨酸、冰醋酸、高氯酸、邻苯三酚、苯酚、浓硫酸、盐酸、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，2，2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐、三羟甲基氨基甲烷（Tris）等均为分析纯。

牛大力鲜叶由湖南中和制药有限公司提供，批次分别为01、02、03，每批次2 kg，由湖南中医药大学第一附属医院李珊副主任药师鉴定为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤（Millettia speciosaChamp.）的叶子。1.1.2 仪器 UV-1700 双光束紫外分光光度计（日本岛津）；BP-211D 电子分析天平（德国Sartorius 公司）；FreeZone2.5 冷冻干燥机（美国LABCONCO）；RE-52 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；HH-S6数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 牛大力叶提取物制备［9］将不同批次牛大力叶置于烘箱60 ℃烘干，粉碎成粗粉，准确称取100 g，第一次加入20倍量水，浸泡0.5 h，加热回流提取2 h，提取液离心，取上清液；第二次加入15 倍量水，加热回流提取2 h，提取液离心，取上清液，转移至旋转蒸发仪中75 ℃减压浓缩至适宜浓度，真空冷冻干燥后粉碎过100 目筛，测得固形物得率分别为：01 批次，16.8%；02 批次，17.3%；03 批次，16.2%。

1.2.2 总多糖的含量测定［3，10］

1）溶液的配制。精密称取D-无水葡萄糖对照品10.25 mg 于100 mL 容量瓶中，加去离子水定容，配制102.5 μg/mL 的对照品溶液。精密称取01 批次牛大力叶提取物50.13 mg 于100 mL 容量瓶中，加去离子水定容，配制501.3 μg/mL 的供试品溶液。

2）标准曲线的绘制。分别吸取102.5 μg/mL 的D-无水葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL到试管中，依次加入水1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL，再分别加入5% 苯酚溶液1.0 mL 和浓硫酸溶液5.0 mL，80 ℃水浴20 min，取适量混合液于分光光度计中490 nm 处测定吸光值。以D-无水葡萄糖质量浓度为X、吸光度值为Y绘制标准曲线，计算线性回归方程：Y=0.084 0X+0.031 7（R2=0.996 8），结果显示，在2.56~12.81 μg/mL，吸光值具有良好的线性关系。

3）方法学考察。参考文献［3］和［10］操作，测得精密度试验、重复性试验、稳定性试验、加样回收率试验的RSD分别为1.03%、0.82%、0.59%、1.06%，表明该方法及仪器均符合要求（回收率具体数据见表1）。

4）总多糖含量测定。按照以上试验操作步骤同法测定02 批次、03 批次牛大力叶供试品溶液吸光值，计算总多糖含量。

1.2.3 总黄酮的含量测定［3，11］

1）溶液的配制。精密称取芦丁对照品9.80 mg于10 mL 容量瓶中，加60% 乙醇定容，配制0.98 mg/mL的对照品溶液。精密称取01 批次牛大力叶提取物100.13 mg 于10 mL 容量瓶中，加60% 乙醇定容，配制10.013 mg/mL 的供试品溶液。

2）标准曲线的绘制。分别吸取0.98 mg/mL 的芦丁对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 到试管中，各加入0.5 mL 的5% 亚硝酸钠溶液，混匀，静置6 min，再加入0.5 mL 的5% 硝酸铝溶液，混匀，静置6 min，然后加入4.0 mL 的4% 氢氧化钠溶液，最后加入60% 乙醇定容至10 mL，静置15 min，取适量混合液于分光光度计中510 nm 处测定吸光值。以芦丁质量浓度为X、吸光值为Y绘制标准曲线，计算回归方程：Y=0.008 2X+0.020 5（R2=0.998 8），结果显示，在19.60~98.0 μg/mL，吸光值具有良好的线性关系。

3）方法学考察。参考文献［3］和［11］操作，测得精密度试验、重复性试验、稳定性试验、加样回收率试验的RSD分别为1.10%、2.41%、1.98%、1.03%，表明该方法及仪器均符合要求（回收率具体数据见表2）。

4）总黄酮含量测定。按照以上试验操作步骤同法测定02 批次、03 批次牛大力叶供试品溶液吸光度值，计算总黄酮含量。

1.2.4 总皂苷的含量测定［3，12］

1）溶液的配制。精密称取人参皂苷Rb1 对照品8.20 mg 于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，配制0.82 mg/mL 的对照品溶液。精密称取01 批次牛大力叶提取物150.24 mg 于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，配制15.024 mg/mL 的供试品溶液。

2）标准曲线的绘制。分别吸取0.82 mg/mL 的人参皂苷Rb1 对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 到试管中，水浴蒸干后加入0.2 mL 的5 %香草醛冰醋酸试液和0.8 mL 高氯酸，60 ℃水浴20 min，取出加入5.0 mL 冰醋酸，混匀后取适量混合液于分光光度计中540 nm 波长处测定吸光度值，以人参皂苷Rb1 质量浓度为X、吸光值为Y绘制标准曲线，计算回归方程：Y=0.003 8X+0.160 4（R2＝0.999 1），结果显示，在27.0~135.0 μg/mL，吸光值具有良好的线性关系。

3）方法学考察。参考文献［3］和［12］操作，测得精密度试验、重复性试验、稳定性试验、加样回收率试验的RSD分别为0.67%、3.95%、4.27%、3.16%，表明该方法及仪器均符合要求（回收率具体数据见表3）。

4）总皂苷含量测定。按照以上试验操作步骤同法测定02 批次、03 批次牛大力叶供试品溶液吸光度值，计算总皂苷含量。

1.2.5 清除DPPH·能力测定 参考文献［13］，分别吸取2 mL 的01 批次不同质量浓度牛大力叶提取物溶液（5.0~30.0 mg/mL）、1.0 mL 0.35 mg/mL 的DPPH储备液加入到试管中，反应30 min 后取适量混合液于分光光度计中517 nm 处测定吸光值Am；另吸取2 mL 水和1 mL 的DPPH 储备液，同法反应后测定吸光值A0；另吸取牛大力叶提取物溶液2 mL 和无水乙醇1.0 mL，同法反应后测定吸光值An。根据公式计算其清除率：

1.2.6 清除ABTS+·能力测定 参考文献［13］，按照体积比2∶1，分别吸取7 mmol/L 的ABTS 溶液和7.35 mmol/L 的过硫酸钾溶液适量进行混合，避光反应16 h，再用水稀释，取适量混合液于分光光度计中734 nm 处测定，调节至吸光值A0为0.70±0.2。再分别吸取01 批次不同质量浓度牛大力叶提取物溶液（1.0~10.0 mg/mL）2 mL 和ABTS 稀释液4 mL 加入试管中，超声30 s，静置反应8 min 后同法测定吸光值A1。根据公式计算其清除率：

1.2.7 清除·OH 能力测定 参考文献［13］，吸取01批次不同质量浓度牛大力叶提取物溶液（4.0~14.0 mg/mL）、6 mmol/L 的FeSO4溶液、6 mmol/L 的H2O2溶液各2 mL 加入到试管中，反应10 min 后加入6 mmol/L 的水杨酸溶液2 mL，反应30 min，取适量混合液于分光光度计中510 nm 处测定吸光值A1；以水代替水杨酸溶液，同法操作后测定吸光值A2；另外以纯水作为空白对照，同法操作后测定吸光值A0。根据公式计算其清除率：

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

3 种不同类型成分测定方法的加样回收率试验数据见表1（样品取样量为501.30 μg，样品中多糖量为40.60 μg，加入对照品量为41.00 μg）、表2（样品取样量为10 013.00 μg，样品中黄酮量为360.98 μg，加入对照品量为343.00 μg）和表3（样品取样量为15 024.00 μg，样品中皂苷量为137.79 μg，加入对照品量为123.00 μg），结果均表明所用方法的准确性良好，能够有效进行含量测定。

表1 牛大力叶提取物总多糖加样回收率测定结果（n=6）

表2 牛大力叶提取物总黄酮加样回收率测定结果（n=6）

表3 牛大力叶提取物总皂苷回收率测定结果（n=6）

2.2 不同类型成分含量的测定

由试验分别测得牛大力叶提取物中总多糖、总黄酮、总皂苷的含量依次为（1.36±0.05）% 、（0.61±0.007）%、（0.15±0.013）%，其中以总多糖含量最高、总皂苷含量最低，结果见表4。

表4 牛大力叶提取物中不同类型成分的含量（n=3）（单位：%）

2.3 体外抗氧化能力评价

由试验分别测得牛大力叶提取物对不同自由基清除能力变化趋势的线性回归方程及IC50，其中IC50由小到大依次为ABTS+·、O-2·、·OH、DPPH·，结果见表5、图1。

表5 牛大力叶提取物对不同自由基的清除能力

图1 不同浓度牛大力叶提取物对不同自由基的清除率

3 小结

试验通过水提法制备牛大力叶提取物，以化学显色法及分光光度法测定不同类型成分的含量，发现其含量高低排序为总多糖>总黄酮>总皂苷，这与其牛大力根所测得成分含量高低趋势基本一致［3］，说明同株植物不同部位的成分类型及含量高低具有一定的相似性。同时，体外抗氧化试验结果显示，牛大力叶提取物对ABTS+·的抗氧化能力最强，而对DPPH·的清除能力则最弱。与已报道的相比，与黄精多糖等效果接近而比白芷多糖、合欢皮多糖、车前子多糖等更强［14］。

因此，可在此牛大力叶提取物的基础上，进一步利用醇沉、柱层析、有机溶剂萃取等方法进行纯化、分离、富集，以获得成分纯度和含量更高、抗氧化活性更强的物质，为牛大力叶的相关产品开发奠定理论基础依据。有关抗氧化作用强弱与不同类型成分间的相关性，将在进一步的试验中展开研究。