白芍总苷对高尿酸血症肾损害大鼠肾脏的保护作用

刘冬恋，秦 琴 ，杨 婷，何欣宇，张雨晴，王玉江

（1.成都医学院四川养老与老年健康协同创新中心，四川成都 610500；2.成都医学院药学院，四川成都 610500）

目前，国内外高尿酸血症的患病率和发生率都在逐年增高，仅中国患者已达1.2亿[1]。对我国5376名老年居民抽样调查发现，我国老年人高尿酸血症患病率为13.1%，尿酸水平和高尿酸血症患病率均随年龄增长而升高[2]。高尿酸血症是指体内嘌呤代谢紊乱，尿酸生成过多或排出过少，引起血尿酸升高，超出血浆正常浓度。高尿酸血症不仅在高血压、心房颤动、心力衰竭、冠心病和心血管死亡等心血管疾病的发生中发挥作用，而且也是肾脏疾病发生和发展的独立危险因素[3-4]。目前治疗高尿酸血症的西药普遍存在不良反应，例如别嘌醇会引起严重的超敏反应，肾功能不全者患者只能由小剂量开始治疗，在治疗期间还应密切观察相关不良反应发生情况，及时给予干预。此外，临床试验表明大约40%～50%的患者单独使用别嘌醇达不到降低尿酸到目标水平[5]。苯溴马隆具有潜在的肝脏毒性。丙磺舒可以与非甾体抗炎药产生相互作用，临床应用受到限制[6]。因此，研究和开发既能有效降低患者血尿酸水平，又能延缓高尿酸血症肾损害（hyperuricemic nephropathy，HN）发生发展的药物，且不良反应少的药物是极具可行性且必要的一项研究。

白芍是我国传统中药材，近年来，科研人员将白芍作为保健食品进行了开发，例如张春婷等对以白芍作为主要原料的保健食品桂芍舒逸口服液进行了工艺优选，建立了质量标准[7]。白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）为白芍干燥根中得到的芍药苷（paeoniflorin）、羟基芍药苷（hydroxy-paeoniflorin）、芍药花苷（paeonin）、芍药内酯苷（albiflorin）、苯甲酰芍药苷（benzoylpaeoniflorin）等具有生理功效成分的混合物，具有消炎[8]、提高免疫功能[9]、保肝[10]、降脂[11]、降低空腹血糖[12]等作用。此外，TGP还可通过增加小鼠粪便含水量，提高肠动力改善便秘症状；调节小鼠肠道菌群结构，促进受损肠道屏障功能恢复[13-14]。

在肾脏方面，TGP可抑制系统性红斑狼疮小鼠血清中干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素6（interleukin 6，IL6）和IL12的表达及dsDNA水平，同时减轻小鼠的肾损伤，抑制小鼠的自身免疫[15]。Lv[16]发现，马钱子总生物碱具有肾脏毒性作用，使大鼠肾脏血尿素氮和肌酐水平明显升高，肾小管上皮细胞浑浊肿胀、变性，肾小球萎缩，TGP可以减弱TAS的吸收，加速其清除，减轻上述损害。本研究制造了HN模型，通过每两周眼眶取血的方式，动态的观察大鼠体重、血清中的尿酸、肌酐、尿素氮等生化指标，然后对肾进行形态学观察，考察和评价TGP对HN大鼠肾脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级雄性SD大鼠50只 体重220±10 g，6±1周龄，购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK（川）2020-030；每只大鼠分笼饲养于成都医学院科研实验中心，许可证号：SYXK（川）2020-196，饲养环境为室温22±2 ℃、湿度55%±5%、12 h光照～12 h黑暗交替。氧嗪酸钾（批号：H2017151） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；腺嘌呤（批号：C11001521） 上海麦克林生化科技有限公司；白芍总苷胶囊（0.3 g/粒，每粒含芍药苷不少于104 mg；批号：200512） 宁波立华制药有限公司；别嘌醇片（批号：20020602） 万全万特制药有限公司；肌酐试剂盒（批号：20201106）、尿素氮试剂盒（批号：2020-1105）、尿酸试剂盒（批号：202001104） 南京建成生物工程研究所；HE染色试剂盒（批号：20200829）、PAS染色试剂盒（批号：20201111）、中性树胶（批号：330A023） 北京索莱宝科技有限公司。

Centrifuge 5415D小型台式高速离心机 德国Eppendorf公司；CP225D精密分析天平 德国Sartorious公司；Varioskan Flash酶标仪 美国Thermo公司；BX63正置荧光显微镜显微镜 日本Olympus公司；Leica RM 2016超薄切片机 美国Feica公司；Specord 50 plus紫外分光光度计 德国耶拿分析仪器股份公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的建立 所有大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组、模型组、TGP低、高剂量组和阳性药物组，每组10只。每天上午7:00和晚上20:00，除正常组外，其余各组分别灌胃制备HN模型（腺嘌呤100 mg/kg+氧嗪酸钾1500 mg/kg，用0.5%羧甲基纤维素钠将两者混合后制成混悬液[17]）。每天中午12:00，TGP低剂量组灌胃给予TGP 100 mg·kg-1·bw-1，TGP高剂量组灌胃给予TGP 300 mg·kg-1·bw-1，阳性药物组灌胃给予别嘌醇27.0 mg·kg-1·bw-1，正常组和模型组灌胃给予等量生理盐水，每天给药1次，持续5周。

1.2.2 检测指标及处理

1.2.2.1 取样及样品处理 每2周称重，然后用眼眶取血方法，每只取血1 mL，然后37 ℃水浴30 min，5000 r/min离心15 min，取血清200 μL。

1.2.2.2 肾重及肾体比的测定 最后1次取血后，颈椎脱臼处死大鼠，取左右肾，分别称重，计算双肾重量与体重之比（肾体比）。

1.2.2.3 血清中尿酸、肌酐和尿素氮的检测 参照试剂盒说明书，采用紫外分光光度计和酶标仪测定大鼠血清中尿酸、肌酐和尿素氮的水平。

1.2.2.4 肾小球和肾小管的病理检测 用生理盐水清洗后，浸泡在10%中性甲醛溶液中固定，常规脱水，石蜡包埋，切片厚3 μm，PAS染色光镜下观察肾小球有无病理变化，HE染色光镜下随机选择10个无肾小球只有肾小管的视野，对肾小管间质损伤和肾脏炎性细胞浸润进行半定量测定，评分标准见表1。利用BX63正置荧光显微镜拍照。

表1 肾小管间质损伤和肾脏炎性细胞浸润评分标准[18]Table 1 Scoring criteria for tubulointerstitial injury and renal inflammatory cell infiltration[18]

1.3 数据处理

计量资料用 x¯±s表示。应用SPSS 21.0软件进行统计分析，组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P＜0.05表示差异有显著性；P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 大鼠的体重变化

结果见表2。与正常组相比，制造了HN模型的各组大鼠体重在第1、3、5周均极显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，在第3周时，TGP高剂量组和别嘌醇组的体重显著升高（P＜0.05），但在第5周时，TGP高、低剂量组和别嘌醇组与模型组的体重均无统计学差异，说明TGP并不能升高HN模型的体重。

表2 各组大鼠不同时间点体重的变化（g）Table 2 Changes of body weight of rats in each group atdifferent time points (g)

2.2 TGP对HN大鼠双肾重与体重的比值的影响

腺嘌呤是制备HN模型的主要药物之一，腺嘌呤会增加小鼠相对肾重、血浆尿素和肌酐浓度，降低体重，引起肾脏DNA损伤[19]。由表3可见，与正常组相比，制造了HN模型的各组大鼠左、右肾重量和肾体比均极显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，TGP高、低剂量组和别嘌醇组的左、右肾重量和肾体比均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），说明TGP高、低剂量和别嘌醇均能降低HN模型的肾重和肾体比。

表3 各组大鼠左肾、右肾重量及肾体比情况Table 3 Weight of left kidney, right kidney and ratio of kidney to body of rats in each group

2.3 TGP对HN大鼠不同时间点血清中尿酸水平的影响

较高的尿酸水平会引发或者进一步发展肾损伤，导致急性和慢性肾脏疾病的发生，所以在临床上，患有高尿酸血症的患者需要检测肾脏功能以便及时发现肾脏损伤[20-21]。由表4可见，与正常组相比，制造了HN模型的各组大鼠第1、3、5周血清中尿酸水平均极显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，TGP低剂量组第1、3、5周血清中尿酸水平较模型组显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TGP高剂量组和别嘌醇组第1、3、5周血清中尿酸水平较模型组均极显著降低（P＜0.01），说明TGP高、低剂量和别嘌醇均能降低HN模型血清中的尿酸水平，但并不能降低至正常水平。

表4 各组大鼠不同时间点血清中尿酸水平的变化（μmol/L）Table 4 Changes of serum uric acid level in rats of each group at different time points(μmol/L)

2.4 TGP对HN大鼠不同时间点血清中尿素氮水平的影响

血清中的尿素氮是从肾小球滤过再排出体外，当肾脏功能失代偿时，血清中的尿素氮将升高，临床通常将尿素氮作为判断肾小球滤过功能的指标[22]。由表5可见，与正常组相比，HN模型的各组大鼠第5周血清中尿素氮水平均极显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，TGP低剂量组和别嘌醇组第1、3、5周血清中尿素氮水平较模型组显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TGP高剂量组第3、5周血清中尿素氮水平较模型组显著降低（P＜0.05，P＜0.01），说明TGP高、低剂量和别嘌醇均能降低HN模型血清中的尿素氮水平，但并不能降低至正常水平。

表5 各组大鼠不同时间点血清中尿素氮水平的变化（mmol/L）Table 5 Changes of serum urea nitrogen level in rats of each group at different time points(mmol/L)

2.5 TGP对HN大鼠不同时间点血清中肌酐水平的影响

血清中肌酐水平是反映肾脏功能的重要指标，血清肌酐升高提示肾功能的损害[23]。急性肾损伤可导致短暂和持续的血清肌酐升高[24]。对于慢性肾脏病患者，血清肌酐是持续要监测的指标之一，血清肌酐含量越高，预后越差[25]。由表6可见，与正常组相比，制造了HN模型的各组大鼠第1、3、5周血清中肌酐水平均极显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，TGP高剂量组和别嘌醇组第1、3、5周血清中肌酐水平较模型组显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TGP低剂量组第3、5周血清中肌酐水平较模型组出现极显著降低（P＜0.01），说明TGP高、低剂量和别嘌醇均能降低HN模型血清中的肌酐至正常水平。

表6 各组大鼠不同时间点血清中肌酐水平的变化（μmol/L）Table 6 Changes of serum creatinine level in rats of each group at different time points (μmol/L)

2.6 TGP对HN大鼠肾小球病理的影响

尿酸升高会造成肾小球损伤，高尿酸会导致肾小球系膜细胞增殖，从而导致肾小球肥大和硬化[26-27]。由图1可见，在400倍光镜下可见，正常组肾小球结构完整，管壁薄，管腔开放，肾小球系膜细胞未见明显异常改变。模型组肾小球出现了中度系膜细胞增生，增生的系膜细胞呈团块状聚集，部分毛细血管受挤压。TGP低剂量组出现了轻度系膜细胞增生，TGP高剂量组和别嘌醇组未出现系膜细胞增生，说明TGP可缓解HN模型肾小球系膜细胞增生。

图1 各组大鼠肾小球病理变化（PAS染色，400×，标尺=20 μm）Fig.1 Pathological changes of glomeruli in rats of each group (PAS staining, 400×, Bar=20 μm)

2.7 TGP对HN大鼠肾小管病理的影响

高尿酸会通过促进活性氧诱导肾小管细胞凋亡，也可诱导肾小管上皮细胞发生上皮-间充质转化，最终导致肾小管间质纤维化[28-30]。由图2可见，在400倍光镜下可见，正常组肾小管形态正常，结构完整，排列整齐，肾小管间质无炎症细胞浸润。模型组有肾小管损伤，表现为肾小管扩张，肾小管间质有炎性细胞浸润。由表7可见，TGP高、低剂量组和别嘌醇组可缓解肾小管扩张，减少肾小管间质损伤和肾脏炎性细胞浸润（P均＜0.01）。

表7 各组大鼠肾小管间质损伤和肾脏炎性细胞浸润评分比较Table 7 Comparison of tubulointerstitial injury and renal inflammatory cell infiltration score in rats of each group

图2 各组大鼠肾小管病理变化（HE，400×, 标尺=20 μm）Fig.2 Pathological changes of renal tubules in each group (HE，400×, Bar =20 μm)

3 讨论

近来的研究表明，TGP中的主要成分芍药苷可明显改善糖尿病肾病小鼠的临床症状，通过抑制iNOS的表达以及TNF-α、IL-1β和MCP-1的产生而减少肾脏中浸润的巨噬细胞数量而治疗糖尿病肾病[31]。TGP可改善急性肾损伤大鼠血清中肌酐和尿素氮水平，增加肾细胞的活力，减轻肾脏细胞凋亡和抑制炎症反应[32]。由此可见，TGP对肾脏发挥着保护作用，但是目前的研究大多停留在研究TGP改善急性肾损害或者糖尿病所致的肾损害方面，对TGP改善高尿酸血症所致的慢性肾损害的研究尚无相关报道。

本课题组研究发现，TGP能降低HN模型的肾重、肾体比，降低HN模型血清中的尿酸、尿素氮和肌酐水平，缓解HN模型肾小球系膜细胞增生，缓解肾小管扩张，减少肾小管间质损伤和肾脏炎性细胞浸润，从而对HN大鼠的肾脏有一定的保护作用。本实验采用别嘌醇作为阳性对照药物，研究结果表明TGP与别嘌醇具有相似的治疗HN的作用，但TGP作为一种天然产物，服用安全，因此TGP在改善HN方面具有一定的应用开发潜力。今后可更深层次的研究TGP对HN的相关基因表达水平的影响。