新型工业化生产低温腌制大头菜挥发性风味物质分析

张钰麟，陈泓帆，赵志平,2, ，康馨樾，聂 鑫，白 婷，王 卫，张佳敏，罗淮良

（1.成都大学肉类加工四川省重点实验室，四川成都 610106；2.宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644000；3.成都医学院基础医学院，四川成都 610500；4.自贡市泰福农副产品加工厂，四川自贡643101）

大头菜又名芥菜，是酱腌菜常用原料，是四川四大酱腌菜之一，深受人们的喜爱。大头菜具有丰富的营养物质，包括维生素、糖类、蛋白质和矿物质等。在绿色蔬菜中，大头菜的蛋白质和氨基酸含量较高，且富含维生素A、维生素C和胡萝卜素。大头菜每100 g可食部分含蛋白质8.7 g、脂肪0.7 g、粗纤维素2.7 g、碳水化合物19.5 g、钙214 mg、磷49 mg、铁8.2 mg[1]。大头菜具有润肠通便、促进消化、利尿消肿等功效[2]。大头菜生食味辣，熟化后味苦，腌制后的大头菜口感脆爽，入口咸香，回味甘甜，具有独特的风味，受到消费者青睐。

大头菜中的硫代葡萄糖苷可在分解后促进人体吸收，Macleod等[3]认为大头菜中由硫代葡萄糖苷产生的异硫氰酸酯是大头菜中的重要香气物质。洪冰等[4]比较接种发酵和自然发酵的大头菜风味发现，接种发酵产生的挥发性风味物质高于自然发酵。郭壮等[5]使用电子舌测得不同地区传统大头菜的滋味，发现腌制大头菜的滋味差异来源于咸味、后味B和酸味三个指标。温度是影响食品风味形成的重要因素[6-7]。洪冰[8]研究发现，大头菜最适发酵温度为27 ℃，此温度下发酵的大头菜的滋味更加鲜美，香气更加纯正浓郁。苏扬等学者研究发现，泡菜的风味形成与乳酸发酵、乙醇发酵、醋酸发酵有关[9]。乳酸菌是大头菜腌制过程中的主要优势菌[10]，在中温环境下，容易过酸和过熟。低温可使发酵缓慢，细菌代谢周期长，代谢过程反应完全[11]。低温发酵在酸奶、面包、果酒等中都有较多研究和应用。低温发酵可使泡白菜挥发性成分丰富，风味比中温发酵的泡白菜更佳[12]。欧阳晶等[13]对腊八豆进行低温发酵，通过测定不同时期的挥发性风味物质，证实了低温发酵产生的风味物质与传统发酵风味物质成分基本相同，但低温可使风味物质聚集更加稳定，稳定产品质量。邓山鸿[14]在脐橙果酒的研究中发现，低温发酵有助于平衡酒体中各香气成分。杨仁琴[15]比较了低温长时间发酵和短时常规发酵酸乳，发现低温长时间发酵酸乳的乙醛和乙酰化合物含量更高，风味更佳。综上所述，低温对发酵产品的风味形成与聚集有较大的正向影响。

传统大头菜多为高盐常温腌制，在腌制过程中使用了大量的盐，腌制后需用大量的清洁水脱盐，不仅增加了生产成本，而且带来了一定程度的环境污染，并且脆度较低。此外，传统大头菜产品含盐量较高，不符合当下低盐化消费理念。低温腌制可解决传统大头菜腌制用盐量高、造成环境污染和脆度低的技术难题。本研究在SPME-GC-MS的基础上，结合ROAV值和PCA分析了工业化生产的不同低温腌制（-1～5 ℃和6～8 ℃）大头菜的风味物质的种类和含量，以期为工业化低温大头菜腌制工艺的优化提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

低温腌制大头菜 自贡市泰福农副产品加工厂提供。

BCD-452WDPF冷藏冰箱 青岛海尔集团；5977A-7890B型气相色谱-质谱联用仪（含PAL3自动进样器） 美国安捷伦公司；赛多利斯万分之一天平 上海民桥精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 低温腌制大头菜加工工艺 将大头菜用冷水清洗，去除泥沙和根须后进行自然风干20～40 d；自然风干后，将大头菜进行分切成2～3 mm厚连接手撕片；分切后，利用60±2 ℃的水进行清洗和浸泡10 min，然后把大头菜取出利用热风振动机在35～40 ℃条件下热风振动15 min，将大头菜干燥。将大头菜和盐（2.5%～3%）放入搅拌机，慢速搅拌3～9 min，装入500 kg坛子，装满后在0～5 ℃条件下腌制1～2 d，进行第一次腌制。完成后，将大头菜取出，再次放入搅拌机，并且加入4%的糖和0.5%～1.5%的盐，慢速搅拌3～9 min，完成后取出；将大头菜装入50 kg坛子，装满密封后放入冷库中分别进行-1～5 ℃和6～8 ℃低温腌制60 d，以此样品作为半成品进行风味分析。半成品经过调味后加工为成品，低温腌制是大头菜自身风味的形成阶段，故采用此阶段的样品进行风味分析。

1.2.2 GC-MS检测 取-1～5 ℃和6～8 ℃低温腌制大头菜，大头菜中间部位宽度为1 cm，切碎成粒径大约为1 mm的颗粒；称取3 g颗粒置于15 mL的顶空瓶中密封，设置CTC自动进样器对样品的前处理条件如下：加热箱温度75 ℃，加热时间45 min，样品抽取时间20 min，解析时间5 min。

色谱条件：参照张旭的方法，稍作改进[16]。HP-5MS UI色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；压力32.0 kPa；流速1.0 mL/min；载气为H e气，不分流进样；进样口温度250 ℃；升温程序：起始温度40 ℃保持1 min，以5 ℃ /mi n升至8 0℃，再以 3℃ /min升至160 ℃，保持1 min，再以20 ℃ /mi n升至200 ℃保持1 min。

质谱条件：电子电离源（EI）；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃；检测器电压350 V；质量扫描范围（m/z）50550。

定性：对化合物进行分析，将得到的数据在仪器的NIST 14.L谱库中进行检索和匹配，选择匹配度高于80%的物质。参考已报道的文献对各色谱峰进行人工解谱并且结合保留指数（RI），取正构烷烃（C10～C25）混标，参照上述方法进行GC-MS分析；利用每个正构烷烃的保留时间，结合公式计算待测组分的RI值。

式中：n为碳原子数；tx为待测组分的保留时间min；tn为碳原子数为n的正构烷烃保留时间，min tn+1为碳原子数为n +1的正构烷烃保留时间，min。

定量：对总离子流量色谱图用峰面积归一化定量，得出各组分的相对含量。

1.2.3 特征挥发性风味物质的评价 为了评价各种挥发性物质对样品风味的影响，采用相对气味活度法（ROAV法）[17]，使得样品风味贡献程度最大的物质ROAVs=100，样品中其他风味物质的ROAV值可通过以下公式计算：

式中：ROAVa是挥发性物质的相对气味活度值；C%a为各挥发性成分的相对含量；C%stan为对样品风味贡献程度最大物质的相对含量；Tstan为对样品风味贡献程度最大物质的感官阈值；Ta为各挥发性成分的感官阈值。对于所有的风味物质，0≤ROAV≤100。0.1≤ROAV＜1，对样品的风味起修饰作用；ROAV≥1的物质为样品的主体风味物质，对样品的风味贡献显著。ROAV值越大，则说明此物质对样品风味贡献越大。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2019进行数据统计，并且以各种风味物质作为变量，采用IBM SPSS Statistics 25.0进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 挥发性风味物质的测定分析

使用SPME-GC-MS对两种不同新型低温腌制大头菜的挥发性风味物质进行分析，其色谱图结果如图1所示。

腌制温度的不同使得两种低温腌制大头菜挥发性风味物质种类以及含量都有所差异。-1～5 ℃低温腌制的大头菜风味物质包含醇类物质3种、酯类物质3种、烯类物质1种、腈类物质1种、酮类1种、醚类1种，平均相对含量分别为2.46%、23.11%、1.90%、5.88%、23.65%、1.20%。6～8 ℃低温腌制的大头菜风味物质包含醇类物质6种、酯类物质3种、烯类物质2种、腈类物质1种、醛类物质1种、酸类物质1种、酮类物质1种、醚类物质1种，平均相对含量分别为12.11%、16.65%、3.86%、3.52%、0.23%、0.38%、1.46%、1.20%。

腌制温度升高后，大头菜中的挥发性风味物质呈现上升的趋势。两种大头菜共有的挥发性物质包括芳樟醇、苯乙醇、桉叶油醇、2-苯基乙基异硫代氰酸酯、2-苯乙基异氰酸酯、对二甲苯、D-柠檬烯、3-甲基异噻唑、茴香脑、2,4,6-三甲基吡啶、左旋樟脑、1-苯基-3-（2-羟乙基）硫脲、苯代丙腈。苯乙醇、异硫氰酸仲丁酯、4-异丙基甲苯、2-正戊基呋喃为-1～5 ℃低温腌制大头菜所独有的风味物质；苯乙醇具有强烈的果香、异硫氰酸仲丁酯广泛存在于芥末、萝卜、山葵中，其只在-1～5 ℃中被检出，能够赋予-1～5 ℃低温腌制大头菜独特的芥末、橡胶气味[18]，十字花科蔬菜加工产品中辛辣风味是由原料中硫代葡萄糖苷在加工过程中，因细胞破损而在硫代葡萄糖酶催化下水解产生异硫氰酸酯类所赋予[19]，Blazevic等[20]利用GC-MS技术对青海月桂种子挥发性分解产物异硫氰酸酯进行了定性和定量分析，发现温度越高使异硫氰酸酯含量越低，这与本研究结果相似。6～8 ℃低温腌制大头菜中未检出异硫氰酸酯，可能是因为硫代葡萄酶因温度升高而逐渐失活。3-甲基异噻唑相对含量由-1～5 ℃低温腌制大头菜中的23.65%下降到6～8 ℃低温腌制大头菜中的1.46%；其是一种肉类香精，香味特征为烤肉香[21]，主要是美拉德反应中间产物和含硫氨基酸降解产物之间发生反应[22]。1-辛烯-3-醇、4-萜烯醇、α-松油醇、螺[2.4]庚-4,6-二烯、P-伞花烃、1-亚甲基-4-（1-甲基乙烯基）环己烷、壬酸、苯乙醛、甲氧基苯肟、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇甲酸酯是6～8 ℃低温腌制大头菜特有的风味物质。亚油酸在脂肪氧合酶催化下产生过氧化氢，经脱氢成酮再被酶转化成1-辛烯-3-醇，赋予6～8 ℃低温腌制大头菜独特的蘑菇香气[23]。朱羽尧等[24]通过对大红袍芳香物质含量及组成分析发现，4-萜烯醇和桉叶油醇的含量受温度影响较大，比较两种物质化学成分发现，4-萜烯醇可通过自身环化反应从而生成桉叶油醇。壬酸作为6～8 ℃低温腌制大头菜唯一酸类物质，能够赋予其油香，有研究证实壬酸可在级联酶的作用下，由不饱和脂肪酸转化而来[25]。通过对上述检测出的挥发性风味物质进行分类以及采用峰面积归一法计算各种风味物质的相对含量，结果如表1所示。

表1 低温腌制大头菜挥发性风味物质种类及含量Table 1 Varieties and contents of volatile flavor compounds in kohlrabi pickled at low temperature

2.2 主体风味物质的ROAV分析

样品的总体风味往往是由相对含量以及感官阈值共同决定的。相对含量高并且感官阈值低的物质对样品整体风味贡献较大。但是不同化合物的阈值不同，某些相对含量较低的物质由于阈值较低也对样品风味贡献较大[27]。参考文献[16,28]以及结合《化合物嗅觉阈值汇编》，共找到17种挥发性风味物质的感官阈值（见表2），分别计算两种低温腌制大头菜每种挥发性风味物质相对含量对感官阈值的比值，比较大小后可以定义苯代丙腈为-1～5 ℃低温腌制大头菜风味贡献最大的物质（ROAV=100），1-辛烯-3醇为6～8 ℃低温腌制大头菜中风味贡献最大的物质（ROAV=100）。结合相对含量以及感官阈值，采用ROAV法对两种大头菜的挥发性风味物质进行分析，以进一步确定关键性的风味物质。两种大头菜中的风味物质ROAV值如表2所示。

表2 大头菜挥发性物质相对气味活度值Table 2 Relative odour activity value of volatile flavor compounds in low-temperature pickled mustard roots

两种低温腌制大头菜一共确定12种关键性风味物质，其中-1～5 ℃低温腌制大头菜共有9种，分别为异硫氰酸仲丁酯、2-正戊基呋喃、D-柠檬烯、桉叶油醇、芳樟醇、苯乙醇、苯代丙腈、茴香脑、2-苯基乙基异硫代氰酸酯。6～8 ℃低温腌制大头菜共有10种，分别为1-辛烯-3-醇、D-柠檬烯、桉叶油醇、苯乙醛、芳樟醇、苯乙醇、苯代丙腈、壬酸、茴香脑、2-苯基乙基异硫代氰酸酯。

醇类物质为两种低温腌制大头菜主要的风味物质，主要由酵母菌发酵产生[29]，多来源于不饱和脂肪酸的氧化降解。醇类物质的感官阈值较高，但是对香气的组成起关键性作用，可以与有机酸发生酯化反应，从而生成可赋予食品果香以及甜香的酯类物质[30]。腌制温度升高后，醇类物质呈现上升的趋势。1-辛烯-3醇随着温度的升高在6～8 ℃低温腌制大头菜中被检出，且ROAV=100，说明1-辛烯-3醇是6～8 ℃低温腌制大头菜中风味贡献较大的物质之一。另外，桉叶油醇、芳樟醇、苯乙醇也对两种低温腌制大头菜的风味贡献较大，它们分别呈现出樟脑香、花香、焦香-杏仁香。

腈类物质是十字花科蔬菜特有的挥发性风味成分[31-32]，它是通过芥子酶的催化活性降解硫代葡萄糖苷而产生的[33-34]。苯代丙腈作为唯一腈类物质在两种低温腌制大头菜中ROAV值都偏大，其在-1～5 ℃大头菜中ROAV为100、在6～8 ℃低温腌制大头菜ROAV为32.89。它是-1～5 ℃低温腌制大头菜贡献率最大的风味物质。

异硫氰酸酯是两种大头菜中主要的酯类物质，是一种化学刺激物，具有独特的特性，可引起热感、灼热感和刺激性气味[35-36]。刘璞等发现榨菜腌制品自身的香气主要来自于异硫氰酸酯类以及腈类物质[37]。

2.3 关键性风味物质的主成分分析

采用主成分分析法区分挥发性风味物质。提取ROAV ≥1的关键性风味物质，根据特征值不小于1的原则，得出两个主成分，如表3所示。两个主成分的贡献率分别为85.33%、12.40%，累计贡献率为97.73%。主成分分析累计贡献率一般达到80%，就可以代表绝大部分信息[38]。

表3 主成分特征值及贡献率Table 3 Principal component characteristic value and contribution rate

表4 是因子载荷矩阵，它反映的是各种挥发性风味物质对两个主成分的重要程度。对PC1贡献较大的挥发性风味物质主要有苯乙醇、桉叶油醇、1-辛烯-3-醇、2-苯基乙基异硫代氰酸酯、异硫氰酸仲丁酯、D-柠檬烯、壬酸、苯乙醛、2-正戊基呋喃、苯代丙腈；对PC2贡献较大的有芳樟醇、D-柠檬烯、茴香脑、苯乙醛。

表4 载荷矩阵Table 4 Load matrix

以PC1（85.33%）、PC2（12.40%）建立主成分载荷图以及两种大头菜的得分图（图2），两个主成分可以反映全部信息的97.73%，提取较为全面。所有的挥发性风味物质分布在第一象限、第二象限、第四象限。离横坐标越远则说明对主成分1的贡献越大，离纵坐标越远的点对主成分2的贡献越大。苯乙醇是对主成分1贡献最大的挥发性风味物质，呈现出果香、玫瑰香气[39]。壬酸、1-辛烯-3醇也是对主成分1贡献较大的风味物质，1-辛烯-3醇又称蘑菇醇[40]呈现出强烈的蘑菇-壤香[21]。此外，1-辛烯-3醇还可以作为医药原料[41]，壬酸呈现出油香味。因此，第一主成分主要反映大头菜的果香、蘑菇香以及油香。对第二主成分（12.40%）贡献较大的挥发性物质有茴香脑、芳樟醇、D-柠檬烯，它们分别呈现大茴香、铃蓝香、花香气，所以第二主成分主要反映的是大头菜的茴香、铃蓝香以及花香。由图2B可知，两种低温腌制大头菜在PC1以及PC2上得分具有差异，说明腌制温度的升高导致低温腌制大头菜风味有所改变。-1～5 ℃低温腌制大头菜与PC2呈高度正相关，6～8 ℃大头菜与PC1呈高度的正相关。

图2 大头菜主成分载荷图（A）及两种腌制温度大头菜的得分图（B）Fig.2 Principal component load diagram and scores of lowtemperature pickled mustard roots

3 结论

SPME-GC-MS分析和ROAV值数据表明，-1～5 ℃和6～8 ℃低温腌制大头菜的挥发性风味物质主要包括醇类、酯类、烯类和腈类，6～8 ℃低温腌制大头菜较-1～5 ℃低温腌制大头菜的关键性风味物质更多。腈类是-1～5 ℃低温腌制大头菜贡献最大的风味物质，而醇类是6～8 ℃低温腌制大头菜贡献最大的风味物质。PCA分析表明腌制温度升高导致低温腌制大头菜风味发生改变。基于代谢组学和微生物多样性分析揭示温度影响低温腌制大头菜风味形成的机理将成为未来研究重点方向。本研究为工业化生产低温腌制大头菜生产工艺的进一步优化提供了理论依据。