猪塞内卡病毒全基因组分析及系统进化树构建

崔慧绮，赵司淼，冉旭华，闻晓波

（海南大学动物科技学院海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室，海南 海口 570228）

A型塞内卡病毒（seneca virus A，SVA），又称为塞内卡谷病毒（Seneca valley virus，SVV），是小核糖核酸病毒科塞内卡病毒属的唯一成员，且只有一种血清型。SVA为单股正链、无囊膜的RNA病毒，呈典型的二十面体对称结构[1]。

SVA 是近几年来在全球范围内流行的猪原发性水疱病（porcine idiopathic vesicular disease，PIVD）的病原体，其症状与口蹄疫、水疱性口炎和猪水疱病的临床症状相似，且难以区分。在临床上，感染猪口腔黏膜、鼻部、鼻腔、远端肢体，特别是蹄冠部位趾间皮肤红肿、发热，然后发白，形成不规则大小各异的水疱[2]；通常表现为厌食、嗜睡、跛行、水疱病变[3]。该病毒对成年猪的影响较小，但对新生仔猪危害较大，容易引起新生仔猪的突发性死亡[3]，严重影响新生仔猪的存活率，对养猪业危害巨大。2002 年，该病毒由马里兰州盖瑟斯堡的一家遗传治疗中心意外从胎儿的成视网膜细胞（C6）中分离得到，并将其命名为塞内卡谷病毒（SVV）[4]，之后对SVA原型毒株的研究主要集中在其抗肿瘤活性方面[5]。起初，对SVA 感染所导致的临床症状、病理变化、传播方式以及流行病学特点和诊断方法等方面的研究均十分有限；同时，因为最初发现的SVA的感染率、发病率都较低，引起自限性疾病且临床症状轻微，主要在加拿大、美国散发，分布位置十分有限，所以并未引起广大学者的重视。2007年，加拿大首次在马尼巴托省发现SVA导致的猪水疱病的病例[6]，并在2008年首次获得了SVA可能与猪水疱病相关的证据，2012 年美国也报道了由SVA导致猪原发性水疱病的病例。自2014 年以来，在巴西[7]、中国[8]、泰国[9]、哥伦比亚[10]等国家均相继出现关于SVA引起的猪水疱病疫情的报道。2015年后，SVA感染所致临床症状明显加重，同时还可导致新生仔猪大量死亡，从而引起专家学者的高度重视。

目前我国对SVA的研究尚处于起步阶段，因此对目前发现的典型SVA毒株进行遗传进化分析，有助于了解该病毒的进化路线，为相关疫苗开发和疾病防控提供参考。通过遗传进化分析可以了解该病毒在全世界的流行与分布趋势，甚至在一定程度上能够推测某些国家和地区所发现毒株的来源，以此追溯该毒株的流入途径，有助于预防新发病毒毒株的传入，有助于疾病防控，以此降低该病对养猪业的危害，提高畜牧业的经济效益。

1 材料与方法

1.1 塞内卡病毒序列的获取

本研究从NCBI（national center for biotechnology information）网站中的GenBank数据库中下载SVA的全基因组序列。选取其中的220条序列作为研究对象。为了保证样本的覆盖范围，提高研究结果的普遍性与准确性，研究中所有毒株均分离自1988 年至2019 年间，分离地域及数量为美国106株、中国81株、加拿大13株、巴西12株、泰国6株、越南1株、哥伦比亚1株。

1.2 多序列比对与重组分析

研究采用MEGA7软件（molecular evolutionary genetics analysis，Hachioji，Tokyo，Japan）中的MUSCLE 比对方法对序列进行排列，剔除由于片段缺失以至于无法对齐的序列，将剩余条序列裁剪为等长的序列，序列长度为7 150 bp。将完成对齐的序列导入重组分析软件RDP5（recombination detection program，http://web.cbio.uct.ac.za/～darren/rdp.html）中进行重组分析。选择软件中的RDP、GENECONV、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan 6 种方法对SVA 的全基因组序列进行重组检测。当6 种方法的结果中出现4个以上阳性信号时，认定重组发生，并从样本中剔除该序列，然后再将剩下的数据导入软件中重新检测，直至最后不再产生4个以上阳性结果的序列。最后留下184条SVA全基因组序列构建系统进化树。

1.3 核酸替换模型的选择

组成DNA的脱氧核苷酸序列的突变是促进基因进化的原动力，这种突变也被称为核酸替代。DNA序列中核苷酸替代数的估计是测定基因间进化距离的数学统计方法，是研究基因进化的基础。最基本的核苷酸序列替代模型包括p-距离模型、Kimura两参数模型和Jukes-Cantor模型以及在此基础上衍生出的一系列其他模型，如Tajima-Nei模型、Tamura 模型、Tamura-Nei 模型等[11]。在系统发育分析中，最大似然法（maximum likelyhood method，ML）和贝叶斯法（bayesian inference of phylogeny，BI）均是常用的进化树构建方法，且两者均是基于选择合适的核酸替换模型才能进行遗传距离计算的方法。因此，核酸替换模型的计算与选择是构建ML进化树和BI进化树必不可少的步骤。

1.4 系统进化树的构建

本研究使用MEGA7.0.26版本软件中的最大似然法构建ML 进化树，参数设置Bootstrap 检验，重复频率为1 000 次，选择核酸替换模型为TN93+G+I，置信区间为95%，其他参数为默认值。构建完成的ML 进化树使用FigTree1.4.4 进行编辑。使用MrBayes3.2.4 版本软件构建BI进化树，选择核酸替换模型为默认GTR模型，设置试验参数，MCMC 采样值为10 000，保证在后面的可能性分布中至少取到1 000个样本。抽样总次数为100 000，抽样频率为10进行计算。构建完成的BI进化树使用FigTree1.4.4进行调整。使用Network10.1.0.0构建系统发育网络[12]，使用星聚法（star contraction）对序列进行预处理，选择中介邻接网络法（median joining）计算序列网络关系，标准选择FHP 计算，其他参数选择默认，将计算出来的结果用最大简约法（MP）进行简化处理。

2 结果与分析

重组是正链RNA 病毒的一种重要的进化机制，通过形成新的嵌合基因组驱动病毒多样性的产生。重组对于病毒而言是有利的，如逃避免疫应答、抗病毒治疗、改变细胞或宿主的趋向性和自身的致病性[13]。研究表明，在国内SVA已经出现了重组毒株，SVA的遗传多样性得到进一步加强[14]。但是，重组的出现会对病毒的遗传进化分析产生干扰，因此通过RDP5 软件剔除36 株重组毒株，重组毒株数量占全部样本的16.4%。

研究构建了ML进化树（见图1）、BI进化树（见图2）和系统发育网络（见图3）。由图1～图3 可知，参与进化分析的所有毒株大致分为三大进化支。第一进化支为1988 年至1993 年间仅在美国部分地区分离的SVA 毒株；第二进化支为1997 年至2008 年间出现的包含SVV-001 在内的典型SVA毒株；第三进化支为2014年往后，该时期内SVA毒株的数量与流行的范围均呈爆炸式增长。

ML进化树和BI进化树中不同颜色的毒株名称代表不同的国家。由图1可知，大多数的SVA毒株存在明显的地域屏障，同一国家的毒株聚类在同一分支上；但也存在一些不同国家的分离株聚类在同一分支上的特殊情况。2007年加拿大最早存在的SVA 毒株CNA-SVA-07-503297-2007-MN233023，该毒株与美国明尼苏达州分离的毒株USA-MN07-00487-MN812944、USA-MN07-00488-MN 812945 序列同源性分别高达99.69%和99.80%。此外，2016 年发现的哥伦比亚株Colombia-SVA-2016-KX857728 与2015 年美国伊利诺伊州发现的毒株USASVA-IL-72-1-2015-MH634530 在进化树上处于同一分支，两者之间的同源性高达98.65%。2018年发现的越南毒株VietNam-SVA-3187-2018-MH704432 与2016 年在中国广西发现的毒株CHN-SVA-GXI09-2016-KY038016位于进化树同一分支上，两者的同源性高达98.64%。

图1 最大似然法构建的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree constructed by maximum likely-hood method

图1、图2中五角星标注的本实验室毒株CHN-SVA1-FL-2019（GenBank登录号：MN922286.1）与2018年在河南驻马店发现的毒株CHN-SVA-HeNZMD-1-2018-MK357115 和2018 年在四川黑水县发现的CHNSVA-HS-01-2018-MH588717、CHN-SVA-HS-03-2018-MH817446 在同一进化分支上。毒株CHN-FL-2019 与HeNZMD-1-2018毒株序列同源性为98.22%，与HS-01毒株的同源性达98.33%，与HS-03毒株的同源性为98.16%。比对结果显示，HS-01 毒株与CHN-SVA1-FL-2019 毒株的同源性最高，但是四川黑水县的两毒株与实验室毒株之间存在0.07%的基因缺失，而实验室毒株与河南驻马店毒株的比对中则不存在基因缺失。将实验室分离毒株CHNFL-2019 与中国最早发现的SVA 毒株CHN-SVA-CH-01-2015-KT321458 作序列比对，得到两者的序列同源性为96.39%。将实验室毒株与美国发现的典型SVA 毒株SVV-001 进行比对，得到两者之间的序列同源性为93.78%。CHN-FL-2019 与目前分离的最早存在的毒株USA-SVA-NC88-23626-1988-MN812936 和USA-SVAMN88-36695-1988-MN812937 的同源性分别为90.79%和91.24%。

图2 贝叶斯算法构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree constructed by Bayesian inference

通过对比两种方法构建的进化树，发现在ML 进化树中，实验室分离毒株及与其亲缘关系较近的毒株单独存在于一个进化分支中；而在BI进化树中，该分支还与哥伦比亚毒株分支及美国GBI29-2015 毒株发生聚类，这些毒株与实验室毒株CHN-FL-2019 分支的同源性范围为98.55%～98.62%。

由图3 可知，随着时间的推移，SVA 的进化过程可以分为3个阶段，分别为散发阶段、过渡阶段以及流行阶段。进一步了解每个阶段包含的毒株，结果与ML方法和BI方法构建进化树的3个进化支中的毒株是相互对应的，进一步验证了前面所构建进化树的准确性，提高了结果的可信度。此外，目前出现的所有SVA 毒株均是以1988 年最早存在的SVA毒株进化而来，所有分支大致均沿一个方向进化，这一结果也与SVA 目前只出现一种血清型的结论相符合。

图3 Network构建的系统发育网络Fig.3 Phylogenetic network constructed by network

3 讨论

本研究中，对从1988 年到2019 年出现的220 株SVA进行全基因组序列的遗传进化分析，所选序列的数量达到GenBank 数据库收录的SVA 全基因组序列的80%以上。本研究构建了ML进化树、BI进化树和系统发育网络。在构建进化树的方法中ML 法是其中较为传统的统计学方法，也是较为常用的最符合实际的一种建树方法。贝叶斯方法构建进化树在病毒遗传发育分析上的应用较少，但是计算结果的准确性也很高[15]。研究发现，这两种方法构建的进化树的结果相似，因此可以同时使用两种方法构建进化树，并进行比较。两者相互佐证能够提高所构建进化树的可信度。Network构建的系统发育网络能够直观地将不同毒株之间的进化关系呈现，从而发现从进化树中不能发现的关系。

1988 年至1993 年分离出的是SVA 的原始毒株，仅在美国部分地区散发，对猪养殖户造成的损害较小，故未引起广泛的关注。2002 年，美国分离出典型毒株SVV-001病毒才被正式命名。2007年之前，SVA只在美国境内存在并散发。2007 年，加拿大的1 例疾病报告显示，自加拿大马尼巴托省运往美国明尼苏达州的一辆载有生猪的运输车中发现了一种特殊的水疱病，该病正是由SVA感染而引起的[6]。本研究中的进化树显示，该加拿大毒株确实与明尼苏达州的两例SVA 毒株聚类在同一分支上且序列同源性极高。由此可以推测，两地出现的SVA疫情可能源于两地之间的生猪贸易，这也是第一次在除美国之外的国家发现SVA 毒株。自2014 年，SVA 首先在美国本土多个州开始暴发流行，并逐渐扩散至其他国家，2015 在巴西和中国广东均出现了SVA引起PIVD的病例，SVA毒株开始跨越了北美洲地域屏障开始在南美洲以及亚洲地域内出现并流行。2016 年，SVA 在哥伦比亚首次出现，有报道称该病毒与美国的GBI29毒株亲缘关系近，从而排除哥伦比亚地区SVA的流行与巴西毒株的关系[10]。本研究中，哥伦比亚毒株Colombia-SVA-2016-KX857728 与USA-IL-72-1-2015-MH634530 的同源性高达98.65%，较USA-GBI29-2015-KT827251 与哥伦比亚毒株的同源性98.21%更高，而聚类在同一进化分支上，这说明在大数据的条件下，能够得出更精确的结论。2018 年，越南地区出现了SVA 毒株，报道称该毒株与中国广西的毒株亲缘关系极近[16]。本试验中的构建的两种进化树得出相同结论。从地理位置上看两者之间是毗邻关系，因此越南的SVA毒株很有可能是从中国广西地区流入的。

对本实验室毒株CHN-SVA1-FL-2019的遗传关系进行分析，发现该毒株与四川黑水和河南驻马店市的毒株关系紧密。CHN-FL-2019所在进化分支中的毒株与美国的GBI29-2015 毒株和哥伦比亚分支之间的同源性达到98.5%以上。对比ML 进化树与BI 进化树之间的差异，按照BI进化树的分类将这些毒株聚类在同一进化分支上似乎更为合理。将FL-2019 与2015 年中国最先发现的SVA毒株、2002 年美国发现的SVA 典型毒株以及1988 年最早分离的SVA 毒株进行序列同源性比对。结果显示，FL-2019毒株与三者的序列差异逐渐增大，表明随着时间的推移，SVA不断地突变、进化，新出现的毒株与原始毒株之间的同源性越来越低。不同地域内的毒株之间不断发生突变和重组，使病毒遗传信息的不断更新换代。由于生存环境的差异最终病毒会朝着不同的方向进化，进化分支也越来越多样化。未来很有可能随着SVA 的扩散与流行而出现新的血清型。

RNA病毒在传播过程中具有很强的环境适应能力，主要依赖其进化过程中的遗传多样性[14]。RNA 作为遗传物质的稳定性不如DNA，因此RNA 病毒复制过程中很容易造成基因的引入替换、插入和缺失。通过RNA 片段的重组可以实现基因的广泛改变，这一过程可以导致病毒表型产生极端变化，例如逃避免疫反应、抗病毒治疗、改变细胞或宿主的趋向性以及改变致病性等[17]。对SVA 全基因组序列进行遗传进化分析能够充分了解SVA 的进化路程及其遗传背景。了解目前世界各地SVA 的分布及其流行情况能够为后续疫苗的筛选制备提供依据。由进化树的结果可知，SVA 的进化过程具有明显的地域局限性，但也存在跨国家聚类的现象，可能与国家之间的猪肉或生猪的进出口贸易有关。Joshi等[18]在出现SVA疫情的猪养殖场内的老鼠以及苍蝇体内检测到SVA的抗体，且核酸检测结果为阳性，表明老鼠或苍蝇等可能作为传播媒介推动SVA的流行。有研究在出现PIVD症状的猪排出的尿液中检测到SVA的核酸，表明尿液也可能是SVA传播的一种途径[19]。

海南省由于其特殊的地理位置，是多种动物疫病的无疫区。2018年，代蕾等[20]对海南省15个市（县）112个规模养殖场和散养户猪群采集血清进行SVA抗体检测，发现检测场点中SVA阳性率为50.0%，样品阳性率为10.9%，说明SVA 不仅已扩散至海南省，并且在快速扩散流行。因此，国家对SVA相关疾病的防控提出了新要求，不仅要加强国家贸易进出口农畜产品的检验检疫工作，还需要加强生猪进出口检疫。此外，随着SVA 在世界各地日益流行，对生猪养殖产业造成的危害日益严重，疫苗研发刻不容缓。因此，本研究对从当前流行毒株中筛选合适的疫苗候选株具有重大参考意义。但是，具体疫苗株的筛选还需对毒株进行病毒活性、稳定性以及免疫原性等方面的检测。

4 结论

塞内卡病毒遗传进化历程以时间为界分为3 个进化支。随着时间的推移，每个进化支中含有的SVA毒株数量逐渐递增，SVA 的分类逐渐细化，病毒的进化方向趋于多样化。