益肺通络汤对肺间质纤维化模型大鼠血清TGF-β1和bFGF及TNF-α表达以及肺组织HYP的影响〔1〕

张爱利，耿志霞，韩冬

(山西中医药大学附属医院，山西 太原 030024)

特发性肺间质纤维化(IPF)是一种原因不明、慢性进行性纤维化性的间质性肺病[1]，以慢性炎症损伤及肺间质过度纤维沉积为特征。肺纤维化发病率不断上升[2]，严重影响了患者的生活质量，目前临床尚无特效治疗方法。近年来中医药在肺间质纤维化实验研究中具有独特的优势，并显示出明确的作用靶点[3]。本研究采用博莱霉素复制大鼠肺纤维化模型，探讨益肺通络汤拮抗肺纤维化的作用机制。报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠60只，体质量(180±20)g，所选动物均购置于山西医科大学实验动物中心。

1.2 药品及仪器

主要药物：注射用博莱霉素(浙江海正药业股份有限公司，国药准字H20055883)、醋酸泼尼松片(浙江仙琚制药股份有限公司，批号：170219)、3.5%水合氯醛、20%乌拉坦溶液。益肺通络汤(方药组成：蛤蚧1对，紫河车粉10 g，黄芪30 g，五味子10 g，麦冬20 g，瓜蒌20 g，地龙10 g，蜂房10 g，全蝎6 g)，由山西中医药大学附属医院中药房提供，山西中医药大学附属医院制剂室代煎浓缩成1 mL含生药量2 g的药液。主要仪器：AT-858型自动酶标分析仪(上海安泰分析仪器有限公司)、KDC-1044低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)、分析天平(北京Sartorius BL121SS)、Lumino化学发光免疫分析仪(深圳新产业生物医学工程有限公司)、羟脯氨酸(HYP)测定试剂盒(南京建成生物工程研究)和转化生长因子β1(TGF-β1)试剂盒、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)试剂盒及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(上海江莱生物有限公司)。

1.3 分组及造模

清洁级雄性SD大鼠60只，采用简单随机数字表法，分为空白对照组(空白组)、模型组、泼尼松对照组(泼尼松组)、益肺通络汤组(中药组)，每组15只。空白组不进行造模，其余3组以3.5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，麻醉生效后将其仰卧固定于手术板上，剪去颈毛，皮肤常规消毒，无菌操作下作长约1 cm的颈中切口，钝性分离后充分暴露气管，用1 mL注射器在环状软骨间隙部位刺入气管腔，向气管内滴注博莱霉素5 mg/kg，完毕后将大鼠直立、旋转，使药物在大鼠肺内分布均匀，缝合皮肤，局部消毒防止感染，动物清醒后置笼内常规饲养。造模后大鼠出现精神萎靡、行动缓慢、皮毛色暗无光泽、饮食减少、呼吸急促、口鼻有分泌物，提示造模成功。

1.4 给药方法

造模成功后各组均于术后第2天开始灌胃给药，剂量如下。空白组：每日给予2 mL蒸馏水；模型组：每日给予2 mL蒸馏水；泼尼松组：每日予醋酸泼尼松片混悬液灌胃，按体质量3 mg/kg给药；中药组：灌服益肺通络汤溶液，按生药材计算每日给药剂量(20 g/kg)，转换为大鼠的等效剂量为3.5 mL/kg，相当于临床用量的7.5倍。4组均为每天给药1次，连续给药28 d。

1.5 标本采集

造模28 d给药结束后，称重，20%乌拉坦溶液(5 mL/kg)腹腔注射麻醉后固定到大鼠解剖台，打开腹腔，腹主动脉取血3 mL，将其静置于4 ℃冰箱2 h，取出后3 000 r/min，离心20 min，将其血清置于-80 ℃冰箱内保存待测。将肺脏组织完整取出，在生理盐水中快速洗去血液，用分析天平称重，计算脏器指数。肺组织HYP含量检测：对肺组织进行匀浆处理，标本匀浆后3 000 r/min离心10 min，取上清液于冻存管中并置于液氮罐保存备用。

1.6 观察指标

肺脏系数计算方法：肺脏系数=肺湿重(mg)/体质量(g)×100%。测定肺组织HYP含量：按照试剂盒说明书检测HYP含量。TGF-β1和bFGF及TNF-α：采用酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)测定各组大鼠血清TGF-β1和bFGF及TNF-α的含量。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 一般情况

空白组大鼠状态良好，活泼喜动，皮毛光泽鲜亮，呼吸饮食正常，口、耳、鼻无异常分泌物。模型组精神萎靡，行动缓慢，皮毛色暗无光泽，饮食减少，呼吸急促，口鼻有分泌物。泼尼松组活动量减少，皮毛少泽，口、耳、鼻分泌物量少，状态略好于模型组。中药组大鼠皮毛光泽欠佳，饮食正常，呼吸平稳，口、耳、鼻无异常分泌物。四组均无异常死亡。

2.2 对肺损伤大鼠肺组织的影响

2.2.1 对大鼠肺脏系数影响

肺脏系数越大，说明肺纤维化程度越明显。与空白组比较，模型组肺脏系数明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，泼尼松组、中药组肺脏系数均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与泼尼松组比较，中药组肺脏系数无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

2.2.2 对大鼠肺组织HYP含量的影响

肺组织HYP含量可以直观地反映机体肺组织胶原代谢的情况。实验结果显示，与空白组比较，模型组肺组织HYP值明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，中药组肺组织HYP值明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与泼尼松组比较，中药组肺组织HYP值降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠肺脏系数及肺组织HYP含量的比较

2.3 各组大鼠血清TGF-β1和bFGF及TNF-α水平比较

与空白组比较，模型组大鼠血清中TGF-β1和bFGF及TNF-α明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，泼尼松组、中药组大鼠血清中TGF-β1和TNF-α及bFGF明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与泼尼松组比较，中药组大鼠血清中TGF-β1和TNF-α及bFGF降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠血清TGF-β1和bFGF及TNF-α水平比较

3 讨 论

肺间质纤维化是临床常见病，是一种慢性进行性的复杂疾病。临床研究[4]表明，肺间质纤维化的发生是一个多因素过程，常伴有细胞因子、生长因子、炎症介质及趋化因子等活性物质的参与。TGF-β1可上调胶原和纤维黏连蛋白的表达水平，使细胞外基质合成并沉积，尤其在损伤愈合时，TGF-β1的上述作用更加明显，导致肺纤维化的形成[5]。bFGF可以促进成纤维细胞增生和胶原纤维合成，对调控肺成纤维细胞分裂、增殖及胶原蛋白的合成与降解起重要作用[6]。有资料[7]表明，bFGF是一种致纤维化细胞因子，参与组织的修复和纤维化，在多种器官的纤维化中发挥作用。TNF-α是肺纤维化发生发展过程中的一个重要因子，尤其是在肺损伤期的高度表达激发了其他致纤维化细胞因子的活性[8]。羟脯氨酸主要存在于胶原蛋白中，胶原是细胞外基质中最丰富的结构蛋白。肺组织中HYP含量是肺纤维化程度的重要标志。中医中无肺纤维化病名，临床根据其症状表现特点归属于中医学“咳喘”“肺痹”“肺痿”范畴，病位在于肺，与脾、肾存在紧密的联系[9]。多为本虚标实之证，肺肾亏虚为本，瘀痰阻络为标。外邪侵袭，肺失宣肃，水道不通，积聚成痰；肺气亏虚，气运不畅，气不行血，血液停滞而形成淤血；痰淤胶结，痹阻肺络，肺气损伤，日久病及于肾，最终导致肺肾亏虚、痰淤阻于肺络。这与肺纤维化弥漫性肺泡炎、肺泡结构紊乱、成纤维细胞过度增殖、细胞外基质过度沉积等病理变化过程相一致[10]。益肺通络汤由蛤蚧、紫河车粉、黄芪、麦冬、五味子、瓜蒌、地龙、蜂房、全蝎组成，适用于肺肾两虚、痰淤阻络型肺痹。纵观全方，蛤蚧补肺益肾、纳气定喘，现代研究表明其还有抗缺氧、抗炎等功效；紫河车粉具有温肾补精、益气养血的功效，可调节免疫系统，提高机体免疫细胞活性与数量[11]；黄芪入脾肺二经，补益肺脾之气；麦冬滋肺肾之阴；五味子可敛肺、滋肾、生津、涩精，常用于肺虚喘咳[12]；瓜蒌具有清肺化痰、抗菌之功效；蜂房清热散结、消肿止痛，现代药理研究表明其具有抗炎、调节免疫等作用[13]；地龙具有平喘通络功效；全蝎可化瘀通络、攻毒散结。诸药攻补兼施，共同起到补肺益肾、化痰祛瘀、通络平喘的功效，在临床应用中取得了较好的疗效。实验结果显示益肺通络汤对肺纤维化大鼠血清TGF-β1，bFGF，TNF-α和肺脏系数及肺组织HYP含量有明显降低作用，从而有效治疗肺纤维化，其机制可能与降低肺部炎症因子水平和抑制HYP胶原蛋白的表达有关，为临床治疗肺纤维化提供新的思路。