猪附红细胞体与奇异变形杆菌混合感染的诊断与治疗

李海蓉，夏九鲜，李建华，郭学勇，李德勤，张圆嫒

（1.安宁市畜牧兽医站，云南安宁 650300；2.昆明市西山区动物防疫检疫服务中心，云南昆明 650100；3.安宁市青龙街道办生态环境和农业农村综合服务中心 650308；4.安宁市农业农村局农产品监督站，云南安宁 650300）

猪附红细胞体与奇异变形杆菌的混合感染主要在哺乳类动物和年龄品种各不相同的猪中传播感染，但相对来说猪发病是最高的，其他哺乳动物几乎不发病。混合感染病情复杂，发病症状同其猪瘟等猪的常见病具有相似性，常常被误诊，给治疗带来不便。若诊断不当、治疗不及时，猪个体短期内会发病病死，造成重大经济损失。

目前，针对猪附红细胞体和奇异变形杆菌的混合感染的研究相对较少，也没有具体治疗方法，在预防和治愈方面还比较薄弱，导致猪传染率和病死率都较高。本研究提供了诊断和治疗方法，可以适当预防和治疗此病，降低传染率和病死率，为研制相应的药物和疫苗提供了参考。

1 材料与方法

1.1 研究背景

2017年2月7日安宁青龙顾建安养猪场爆发了一场地方性流行疫病，主要表现为，发病猪精神萎靡、高热、黄疸、便秘、可视黏膜苍白、两耳肿胀发绀，最后病死。

1.2 研究材料

样品为猪场送来的猪全血、猪内脏。

试剂为2%去氧胆酸钠溶液、Trizol Reagent试剂、氯仿、丙醇混合溶剂、75%乙醇溶液、dNTP、蒸馏水、10 × PCR buffer、Taq DNA酶、ddH2O、胰蛋白胨氯化钠溶液、姬姆萨染色液、瑞氏染色液、吖啶橙染色液、RNase抑制剂和AMV-RT。

培养基为血液琼脂培养基、鸟氨酸脱竣酶培养基、氧化酶培养基、葡萄糖培养基、赖氨酸脱竣酶培养基、苯丙氨酸脱氨酶培养基、脉酶培养基、乳糖培养基、卫矛醇培养基、1.5%琼脂培养基。

试验器材包括PCR仪、EP试管、离心管、移液枪、离心机、电泳仪、载玻片、显微镜、接种针、消毒牙签、恒温培养箱、水浴锅等试验器材。

1.3 诊断方法

1.3.1 病猪剖检

对发病猪进行剖检，观察病猪的病变部位及病变程度。

1.3.2 直接镜检

取适量发病猪送检样品中的猪全血，滴于载玻片上，并在其中加入等量氯化钠溶液，然后小心盖上盖玻片，压实。相同步骤制作相同样品载波片2份以备用，随机取制作完成的载波片，在油镜下观察细胞的形态。

1.3.3 涂片镜检

无菌采取正常猪血制作载玻片，作为阴性对照。对猪血进行姬姆萨染色、瑞氏染色、吖啶橙染色在显微镜下观察。

1.3.4 RT-PCR检测

（1）利用病毒核酸提取试剂盒对猪组织样进行病毒核酸的提取；根据GenBank中登录的基因，设计一对引物，预计PCR扩增产物长度为602 bp。反应体系见表1。

表1 PCR反应体系

（2）反应步骤为: 94 ℃ 热变性5 min，94 ℃变性45 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min，做30～35个循环。

（3）PCR产物用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，运用凝胶图像分析系统观察，针对电泳条带进行密度扫描鉴定。电泳检测cDNA。将制好的凝胶板水平放入电泳槽，将样品用移液枪加到凝胶孔中，打开电源将电压调节至120 v，电泳25 min。电泳结束后在成像分析系统观察凝胶形成的条带并记录结果，见图1。

图1 cDNA电泳实验结果（1.PCR扩增样品；2.阴性对照）

（4）PCR特异性实验。用该引物和反应条件对猪支原体、圆环病毒、猪瘟病毒、蓝耳病毒、伪狂犬病毒等基因组和SPF猪血DNA进行扩增，以验证PCR的特异性。

（5）临床样品检验。取猪全血样品20份，样品为鲜血涂片镜检和临床症状都疑似猪附红细胞体感染的，进行PCR检测。重复检测结果为假阴性的样品。当检测时，将未加DNA模板的反应体系分为2份，1份加阴性样品DNA，1份加阳性样品DNA作为对照。

1.3.5 细菌培养镜检

在无菌条件下，将肝脏组织取适量接种于营养琼脂培养基置于37 ℃恒温环境下培养24～48 h，观察生长状况。挑取单个长势良好的菌落进行革兰氏染色并进行镜检，并富集培养和纯化，分别接种于麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基、血琼脂培养基、营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基，置于37 ℃恒温箱下培养24～48 h，观察生长状况。

1.3.6 生化实验

（1）发酵实验。将细菌培养获得的菌落用实验室消毒后的牙签挑取分别接种到脉酶培养基、氧化酶培养基、赖氨酸脱竣酶培养基、卫矛醇培养基、苯丙氨酸脱氨酶培养基、鸟氨酸脱竣酶培养基、乳糖培养基、以及葡萄糖培养基之上。然后将其置于恒温37℃培养箱进行培养18～24 h，观察结果。

（2）动力实验。取胰蛋白胨的半固体培养试管，用接种针挑取细菌培养获得的待测细菌，垂直半固体琼脂表面往下插入，在距离培养试管底部还有5 mm左右时垂直抽出接种针，若穿刺线周围有扩散生长，则为阳性。

2 结果与分析

2.1 剖检结果

解剖后发现以下几点病状，见图2。

图2 发病猪病理解剖图（a. 内脏；b. 肾脏；c.肺；d. 肝脏）

（1）血液颜色为暗红色且较为稀薄，凝血性下降。

（2）在胸前、腹股等部分的淋巴结肿大出血，使用手术刀切割后发现切面会流出一定量黑红色的液体，并伴随有一定的化脓现象。

（3）心脏积液，心肌出血病变；肝脏肿胀出血，呈棕黄色。

（4）肾脏肿胀出血；肺部肿胀出血，偶见血斑块；肠系水肿出血，有特殊气味。

2.2 直接镜检结果

在油镜下观察使用猪全血制作的玻片，在红细胞和血浆中表面附着一些丝状体或圆形虫体，红细胞形状变异，多呈星星状或锯齿状，正常形态的红细胞几乎没有，见图3（a）。

2.3 涂片镜检结果

（1）观察姬姆萨染色后，红细胞边缘变为锯齿状，酷似菠萝，不再有圆滑表面；形状残缺不全，颜色呈淡蓝紫色，见图3（b）。

（2）瑞氏染色后观察细胞相对变大，有一些染色相对较深的颗粒状物附着于红细胞表面或突出部位，见图3（c）。

（3）在荧光显微镜下观察吖啶橙染色后，红细胞多数变为暗绿色，其中并有一些细小的单体存在，呈现橘黄色，形成强烈对比，见图3（d）。

图3 镜检结果图（a. 血涂片；b. 姬姆萨染色；c. 雄虫体前部瑞氏染色；d. 吖啶橙染色）

2.4 RT-PCR检测结果

RT-PCR检测结果表明，仅猪附红细胞体血涂片镜检为阳性，其他病原检测结果均为阴性，见表2。

表2 PCR实验结果

2.5 细菌培养镜检结果

（1）营养琼脂培养基。细菌菌落呈乳白色，有明显的迁徙生长现象。

（2）麦康凯培养基。细菌菌落整体为圆形扁平状，细菌半透明，呈黄褐色，同样在菌落边缘具有明显的迁徙生长现象。

（3）营养肉汤培养基。在37 ℃恒温细菌培养箱培养24 h后，肉汤变得轻度浑浊。继续培养48 h后，肉汤培养基中出现了一定量的絮状沉淀物。

（4）血琼脂培养基。细菌菌落呈灰白色，平铺布满培养基，有溶血现象，并散发出一股腐败性臭味。

（5）将该菌置于光学显微镜下，发现该菌形态多样，部分呈杆状，部分呈球状，无芽孢及荚膜。

图4 细菌培养结果

2.6 生化实验结果

观察整理细菌接种培养基实验结果，苯丙氨酸脱氨酶阳性，鸟氨酸脱竣酶阳性，脲酶阳性，发酵葡萄糖，产酸产气，见表3。

表3 细菌接种发酵实验结果

观察该菌动力实验结果，发现穿刺线模糊，于侧光条件下可发现穿刺线周围有该菌扩散生长的痕迹，确定动力实验为阳性。

3 治 疗

3.1 治疗方法

（1）血虫净（兰州正丰制药有限公司生产）。用量3～5 mg/kg，肌内注射或者静脉注射，每天用药1次，连用3次（三氮脒有一定毒性，使用时注意用法用量）。

（2）长效土霉素（河北远征药业有限公司生产）。用量0.05 mg/kg，肌内注射，每天用药1次，连用3次。

（3）中药配方。白术100 g、干姜50 g、山药30 g、生姜30 g、大枣30 g、茯苓20 g、车前草10 g混合加水煎煮拌料喂食，每天1次，连续灌服1周。

3.2 治疗结果

治疗3～5 d后，病情得到控制，发病症状缓解，并未见健康猪发病，猪群进食状况改善，偶见水样粪便；1周后，无猪感染，发病症状基本消失，猪群进食状况良好，粪便正常。

4 讨 论

通过一系列的研究将此次疫病诊断为猪附红细胞体和奇异变形杆菌的混合感染，过程严谨并排除实验错误的可能性。附红细胞猪体感染与很多疾病的临床症状很相似，因此如果只看临床症状无法确诊，必须借助实验室检测。相对于附红细胞体而言，目前没有好的体外培养方法，难以鉴定病原体。判断猪是否感染只能对猪全血样品涂片染色进行镜检，但经常由于染色剂和一些外在因素的影响，“假阳性”现象经常出现在结果里，如未成熟红细胞的形态和附红细胞体感染后红细胞相似，会导致误判成阳性。

除此之外，鉴定实验还经常用补体结合实验，酶联免疫吸附实验，荧光抗体实验，间接血凝实验等。但这些实验诊断经常会因为猪感染了附红细胞体后，导致免疫力降低，从而影响血清学实验结果。除此之外，病原也无法彻底准确的被检测出来。研究时主要采用血涂片镜检和RT-PCR进行结合诊断，相对来说，准确度更高，结果更可靠。

近年来，对于奇异变形杆菌的感染报道很多在畜牧生产上，但由于对此菌的研究很少，导致预防和治疗都有很多困难，并且此菌有很强的耐药性和变异性，目前还没有药物可以彻底进行治疗。而且猪附红细胞体发病后，会大大降低猪的抵抗力，细菌性疾病较容易感染。