基于异氟尔酮的L-精氨酸探针光谱性能研究

张 玉，顾峥烨，徐洪耀*，光善仪*

1.东华大学化学化工与生物工程学院和生态纺织教育部重点实验室，上海 201620 2.东华大学分析测试中心与材料学院和纤维改性国家重点实验室，上海 201620

引 言

氨基酸是一种含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物，它既是生命体中蛋白质的基本组成部分，同时也是参与生命体的修复和再生的必须物质[1]。在20种天然氨基酸中，精氨酸(L-Arg)有不可代替的优势，在一端的旁链处存在着高碱性的胍基，其pKa高达12.48，使得其在酸性、中性及碱性条件下均带正电荷[2-3]。L-Arg作为NO(一氧化氮)的前体，在动物的生存，繁殖，生长，抗衰老和免疫方面起着重要的作用。越来越多的临床试验表明，在饮食中适当填加L-Arg可以减轻体重，降低动脉血压，抵抗氧化并使内皮功能正常化，从而缓解高血压[4]，同时也可以促进孕妇在孕期胎盘和胚胎的生长[5]。精氨酸在细胞分裂，伤口愈合，免疫系统，激素的释放，尤其是基因调节，糖蛋白靶向和囊泡运输中起着重要作用[6-7]。因此，对精氨酸的选择性识别研究是生物化学和医学科学领域的关键课题之一[8-9]。

目前，报道检测L-Arg的方法有很多但均存在一些缺点，如使用高效液相色谱法(HPLC)[10]检测时对L-Arg的选择性差，采用电化学[11]方法检测时对于精氨酸甲基化蛋白的修饰过程比较复杂，选择离子交换色谱法[12]检测时对方法条件及仪器均具有较高的要求，利用毛细管电泳[13]检测时样品处理过程较为复杂，从而限制了它们在实际生活中的应用。因此，操作简单迅速，高灵敏度以及价格低廉的探针就成了有效检测氨基酸的方法之一。

比色探针作为一种可以通过检测分析物的颜色及吸收光谱变化的检测方法，可以实现对氨基酸定性以及定量的检测分析。因此，基于异氟尔酮设计并合成了可以用于精氨酸(L-Arg)检测的一种新型比色探针ISO-CN-OH。通过对ISO-CN-OH进行光谱性能研究，发现ISO-CN-OH对L-Arg具有高选择性以及高灵敏性，并通过紫外可见吸收的Job’s plot曲线及1H-NMR核磁滴定波谱，详细研究了探针ISO-CN-OH与L-Arg的配位机理，并利用配位模型图模拟出ISO-CN-OH与L-Arg的配位过程。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

上海豫华仪器有限公司DF-101S集热式恒温式加热磁力搅拌器；瑞士Bruker公司Bruker AVANCE/DMX600型核磁共振仪器；美国热电集团Nicolet 8700型傅里叶变换红外光谱仪；PerkinElmer UV/Vis Spectrometer Lambda 35。所用药品试剂和溶剂均为市售分析纯。

异氟尔酮-丙二腈(ISO-CN)按照文献[14]的方法合成。

1.2 ISO-CN-OH合成方法

探针ISO-CN-OH的合成路线如图1所示。

图1 ISO-CN-OH合成路线

2 结果与讨论

2.1 探针ISO-CN-OH对氨基酸的光学吸收性能研究

选择21种常见的氨基酸作为研究对象，探究了探针ISO-CN-OH与不同氨基酸之间的紫外可见光谱性能，实验结果如图2(a)所示。发现在DMSO/H2O(95/5,V/V, PBS=7.0)溶液中，探针ISO-CN-OH本身在471 nm处呈现吸收峰，当分别向探针中加入10当量的L-His，L-Ala，L-Gly，Cys，L-Val，L-Pro，L-Leu，L-Phe，L-Ser，L-Met，L-Glu，L-Asp，L-Lys，L-Thr，L-Tyr，GSH，L-Asn，L-Trp，L-lle和L-Gln时，在471 nm处的吸收峰并没有发生明显的改变，但是在669 nm处出现了新的微弱的吸收峰，且溶液的颜色并无明显的改变。仅向溶液中加入10当量的L-Arg时，光谱在669 nm处出现强吸收峰且溶液颜色由原本的橙黄色变为了墨绿色。该吸收光谱实验结果表明，探针ISO-CN-OH是对L-Arg具有高度选择性的比色探针，且响应灵敏，检测结果肉眼可视。

为了排除共存的氨基酸对L-Arg的识别产生干扰，进行了对L-Arg的竞争性实验测试。在其余20种氨基酸的ISO-CN-OH溶液中分别加入等当量的L-Arg，由图2(b)可知，其余20种氨基酸的存在并不会影响探针ISO-CN-OH对L-Arg的紫外识别。因此，探针ISO-CN-OH对L-Arg的紫外识别具有较强的抗干扰能力。

图2 (a)探针ISO-CN-OH(10-5 mol·L-1)对氨基酸(10-4 mol·L-1)的选择性识别；(b)ISO-CN-OH(10-5 mol·L-1)对L-Arg及共存氨基酸(10-4 mol·L-1)的竞争性实验

2.2 光谱吸收滴定曲线分析

在DMSO/PBS(95/5,V/V, PBS=7.0)体系中，进行紫外-可见光谱滴定实验研究。如图3(a)所示，随着L-Arg浓度的增加，探针ISO-CN-OH在669 nm处的吸收峰强度逐渐上升，441 nm处的吸收峰逐渐下降，这表明ISO-CN-OH与L-Arg形成了稳定的复合物。除了在669 nm处产生新的吸收，在550 nm处还出现了等吸收点，这也为ISO-CN-OH+L-Arg络合物的形成提供了进一步的证据。当L-Arg的浓度在1.0～10.0×10-6mol·L-1范围时，根据ISO-CN-OH+L-Arg在669 nm处的吸收强度与不同浓度做线性回归曲线，线性回归方程式为y=0.020x+0.073，R2=0.997，如图3(b)所示，根据DL=3σ/K，其中σ为探针ISO-CN-OH溶液平行测试20次的标准偏差，K为线性回归方程的斜率，可计算出检出限为8.5×10-8mol·L-1。

图3 (a)探针ISO-CN-OH(10-5 mol·L-1)随L-Arg(10-6～10-4 mol·L-1)浓度变化的紫外可见光谱图；(b)相对吸收强度A-A0与L-Arg浓度变化的线性曲线

2.3 吸收光谱的Job’s plot滴定曲线分析

通过固定探针ISO-CN-OH与L-Arg的总浓度为100 μmol·L-1，改变L-Arg占总浓度的比例，测其在669 nm处的吸收强度。由此获得探针ISO-CN-OH对L-Arg的Job’s plot滴定光谱吸收曲线，如图4所示。当L-Arg占总浓度比例为0.67时，发现探针ISO-CN-OH在669 nm处紫外吸收强度达到最大值，根据计算公式n=Xmax/(1-Xmax)可得n=2，表明探针ISO-CN-OH与L-Arg以1∶2的络合比进行配位络合。

图4 探针ISO-CN-OH与L-Arg的Job’s plot滴定曲线

2.4 核磁共振光谱滴定曲线分析与探针机理研究

在确定了配位比的基础上，通过核磁滴定实验来进一步确定配位机理。在探针ISO-CN-OH的d6-DMSO溶液中分别加入0，0.5，1.0及2.0当量的L-Arg(d2O)，结果如图5(a)所示。当加入L-Arg后，探针上的羟基氢H2(9.83 ppm)和H4(8，76 ppm)峰逐渐消失，如图5(b)放大图所示。此外，羟基周围的氢信号峰发生了向高场的偏移，H1峰从7.08 nm逐渐偏移到6.96 nm，H3峰从6.67 nm逐渐偏移到6.54 nm，H5峰从6.32 nm逐渐偏移到6.10 nm，且在高场区出现了L-Arg的特征峰Ha(3.15 ppm)和Hb(1.54 ppm)，如图5(a)所示。上述结果表明探针ISO-CN-OH上的羟基与L-Arg结合形成了络合物，从而引起了羟基以及周围氢化学环境的变化。出现上述结果的原因是探针ISO-CN-OH具有两个酸性酚羟基，且L-Arg属于强碱，其pKa=12.48，有足够的能力去除羟基中的质子，因此探针ISO-CN-OH通过将酸性的酚羟基质子转移到L-Arg碱性的胍基NH基团上，导致羟基基团附近形成负电荷，该负电荷与精氨酸的胍基部分络合，从而形成了络合物，即ISO-CN-OH与L-Arg通过质子转移形成了稳定的络合物[15]。

图5 (a)在ISO-CN-OH(DMSO-d6)中加入0，0.5，1.0及2.0当量的L-Arg(d2O)的1H-NMR对比图；(b)局部放大图

基于以上光谱分析，可以得到探针ISO-CN-OH与L-Arg的配位模型如图6所示。

图6 探针ISO-CN-OH+L-Arg配位模型

3 结 论

通过设计并合成了一种可以用于检测L-Arg的比色探针，采用各种光谱分析方法，研究了其光学性能及配位机理，发现该探针可以专一性识别L-Arg，溶液颜色发生了从橙黄色到墨绿色的改变。滴定实验表明L-Arg在1.0～10.0×10-6mol·L-1范围内具有良好的线性关系，最低检测限为8.5×10-8mol·L-1，表明该探针对L-Arg具有高灵敏度。基于核磁共振谱滴定的方法，通过对ISO-CN-OH与L-Arg的配位机理的研究，发现ISO-CN-OH与L-Arg是通过质子转移方式形成络合物。本研究为今后L-Arg新型探针分子的设计，提供重要光谱研究方法与分析基础。