农药残留检测中表面增强拉曼光谱的研究进展

邱梦情，徐青山，郑守国，翁士状

1.中国科学院合肥物质科学研究院，安徽 合肥 230031 2.中国科学技术大学，安徽 合肥 230026 3.农业生态大数据国家地方联合工程研究中心，安徽大学，安徽 合肥 230601

引 言

农药是指用于防治农、林业中病、虫、杂草等有害生物和调节植物生长的化学或生物药品，它的种类繁多、作用广泛，极大地提升了农作物的产量以及农业经济的发展。农药残留是指施用农药后，未能分解的残留于环境和农作物中的农药原体、降解代谢物等，它们会通过植物果实、水、大气进入人体。当农药残留量超过国家规定的最大限值时，会对人体造成致畸或致癌等不良影响[1]。因此，如何有效、精确地检测农产品中的农药残留，以减小与监控其对人类健康的危害，已成为当前迫切需要解决的重大问题。

传统的农药残留检测方法有色谱法、质谱法、酶联免疫法等，它们具备选择性和灵敏性高的特点，被认为是标准检测方法。但是这些方法对操作环境要求高、分析过程复杂费时、设备昂贵且需专业人员参与，在实时高效检测中存在一定局限性。光谱方法因其简单，快速，灵敏等特点被视为农药残留检测中有前景的途径，包括近红外光谱(NIR)，傅里叶变换红外光谱(FTIR)，拉曼光谱(RS)和SERS[2]。其中NIR和FTIR易受水性环境干扰，在农残检测中的应用有限。RS是一定激发光照射到样品表面时，不同物质的分子振动方式不同，产生不同频率的散射光光谱，也称为“指纹光谱”，可提供物质的分子结构信息且不受水相的影响，但由于拉曼散射固有的横截面小的特点导致其灵敏度较低，引起信号弱、检测精度差等问题。相比之下，SERS通过合成贵金属纳米颗粒(Au，Ag等)为基底实现拉曼散射强度增强，在获取待测物指纹信息的同时，克服了RS灵敏度低的缺点，对于定性和定量分析有很大价值，广泛应用于化学、生物学、医学、食品安全等领域。尤其是农残检测方面，SERS已有效检测了有机磷类，有机氯类，菊酯类、杀菌剂类和杂环类等农药残留。

根据SERS的指纹特性，每种农药会产生其特有的拉曼特征峰，因此可通过“特征峰位移”实现待测物的定性或定量分析。为了获得最优特征峰光谱，有必要对活性基底制备以及检测方式进行研究；另外为了使检测结果更加快速、准确，也应对农残的特征拉曼光谱计算模型进行研究。综上，本文主要从SERS的增强基底制备、检测方式以及光谱解析三个方面综述农残检测中SERS的研究进展及趋势，为今后农残的分析检测提供新的参考。

1 农残检测SERS增强基底制备技术

在SERS检测农残中，由于农药种类繁多、成分复杂且残留量较少，因此需制备高活性增强基底以提高对待测物的灵敏性和特异性。近年来，科研人员致力于研究纳米材料并通过各种方法制备均一性好和重复性高的金属纳米材料作为SERS基底实现痕量农残检测。迄今为止，SERS增强基底主要分为两类：贵金属溶胶基底和复合基底。

1.1 贵金属基底制备技术

贵金属溶胶基底主要包括金、银等纳米溶胶颗粒，是SERS检测农残中使用较为广泛的纳米材料，可显著增强其表面吸附的待测物SERS信号强度。目前，常用的金属溶胶制备方法有电化学氧化还原法、化学沉积法、晶种法等。据了解，金属纳米溶胶表面吸附的待测物SERS信号强度取决于感兴趣颗粒的大小和形状。因此，通常制备不同尺寸或形状纳米胶体如球体、棒、立方体、三角形、多面体、枝晶等促进分子键合以提高增强效果，如图1所示。或者在金属溶胶中加入诱发剂如NaCl、NaNO3和半胱胺盐酸盐等使纳米颗粒富集产生大量热点进而提高增强效果[3]。Stamplecoskie等[4]通过晶种法制备银纳米粒子(Ag NPs)并控制其尺寸大小，检测10-3mol·L-1罗丹明6G(R6G)，结果表明Ag NPs的最佳尺寸为50～60 nm时，R6G表面SERS强度最大，这一方法有望推广到其他的吸附材料。Xu等[5]开发一种无需表面活性剂的方法制备爆米花状金纳米粒子(Au NPs)检测果皮表面毒死蜱，最低检测限(LOD)达10-6mol·L-1，符合国家最低标准。本人所在团队采取种子介导的生长法制备金纳米棒(GNRs)活性基底检测圣女果表皮[6]、小麦籽粒[7]中矮壮素的残留，LOD分别为0.5 mg·L-1，0.25 mg·kg-1。

1.2 复合基底制备技术

由于单一的金属溶胶颗粒产生的热点是随机的，且聚集的纳米颗粒不稳定，在重力的作用下沉积导致检测时热点的强度和数量产生波动。因此，为了提高SERS基底的吸附能力或亲和力，使更多的待测物能够在被应用的SERS基底表面被富集并且SERS信号不发生显著变化，需解决常规基底存在的稳定性、灵敏性问题。大多研究人员通过对单一溶胶基底进行组装，加入化学物质、惰性材料等修饰表面以制备高活性SERS复合基底，从而有效、特异地捕获待测物，保证SERS信号的良好重现性和灵敏性。为此，各种修饰分子如烷硫醇、氨基酸、DNA适配体和氧化石墨烯等常被用作合适的表面修饰剂。例如，Huang等[8]通过在十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)和硫醇化环糊精(β-CDs)的混合水溶液中还原氯金酸，合成具有对称单晶结构的金纳米晶，由主干和侧枝组成如图2所示。该金纳米晶对甲醇的氧化具有良好的电催化活性，对氨基苯硫酚(4-ATP)分子的SERS敏感性较好，表明其在催化、生物传感和纳米器件等方面具有潜在的应用前景。另外，还通过将磁性材料和贵金属颗粒复合如利用硝酸银还原法在共沉淀法制备的Fe3O4表面沉积Ag NPs获得Fe3O4@AgNPs磁性复合材料，使待测物在外磁场作用下产生富集，从而实现待测物的超灵敏检测。

图2 金纳米晶的合成

近年来，研究发现TiO2和CdTe等半导体在优化的条件下有较大的106以上增强。此外，金属-半导体复合纳米材料被发现能够比纯金属衬底显示更高的增强，归因于金属和半导体对SERS的协同贡献。因此，这类SERS增强基底在农残检测中具有很大的潜力。例如，厦门大学田中群院士团队长期从事电化学表面增强拉曼光谱(EC-SERS)方法学研究，建立一系列表面纳米化方法，打破学术界长期认为SERS效应局限于金、银和铜等少数金属的观点；同时还研发了壳层隔绝纳米粒子增强拉曼光谱(SHINERS)新技术，首创SiO2薄层包含AuNPs的制备方法，从根本上解决了SERS基底材料和表面形貌普适性差的瓶颈问题，并将实验成果于2010年在Nature上发表[9]，首次将核壳结构Au/SiO2NP组成的“smart dust”喷洒于橘子皮上，实现水果表面农药残留的检测，如图3所示。

图3 (a)柑橘类水果的拉曼光谱，Ⅰ为干净果皮、Ⅱ为被甲基对硫磷污染的果皮、Ⅲ为污染的果皮表面修饰Au/SiO2纳米粒子、Ⅳ为甲基对硫磷粉末；(b)SHINERS实验原理图

2 农残SERS光谱检测方法

在SERS检测农残中，由于分析样品的成分复杂、农药残留量较少，对样品前处理以实现待测物富集是非常关键的。另外，虽然Au和Ag NPs因其制备简单方便被广泛使用，但是易受金属氧化、团聚等因素影响，使得采集信号的灵敏度降低1～2个数量级，不能达到农药残留标准检测要求。并且该方法存在成本高、重复利用率低等缺点，不能满足现场快速检测需求。因此检测方法从使用单一的Au/Ag NPs作为增强基底进行直接检测，逐渐趋向于样品前处理技术优化、特异性SERS探针、纳米阵列结构、廉价金属纳米微粒等方向发展。

综上，SERS检测方法不仅在样品前处理技术优化方面取得进展，在化学修饰以制备功能化特异性探针和增强基底的物理结构等方面获得突破，同时在检测过程中也有了新的方式。这些方法都为SERS技术在农残检测中的应用提供了途径，使得痕量农残SERS检测有更好的发展趋势。

2.1 农残SERS检测样品前处理新技术

样品前处理主要包括样品分解和样品净化两个重要环节。随着样品成分日益复杂、灵敏度和准确度的要求越来越高，样品前处理已经成为决定分析结果可靠性的关键因素。因此，在农残SERS检测中引入新的样品前处理技术实现省时省力、无污染和高效提取与净化是非常重要的。目前，结合SERS取得广泛应用的样品前处理新技术主要有：固相微萃取(SPME)、磁性固相微萃取(MSPME)、液-液微萃取(LLME)等。常用回收率、分离度等指标评估这些方法的性能。例如，SPME-SERS和MSPME-SERS实现甲拌磷、福美双、R6G和毒死蜱等农残检测，回收率均达到70%～120%；LLME-SERS实现扑草净、三嗪类等除草剂农残检测，回收率达80～110%。尽管这些方法减少溶剂的使用并解放实验室的劳动力，但仍存在一些缺陷未能克服，如SPME不能在单个步骤中提供足够宽的分析范围，LLME不能提供足够的选择性。因此，在固相萃取技术的衍生和进一步发展中，提出了一种快速易用的前处理方法—Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe(QuEChERS)方法，其重点是在萃取和清理过程中尽可能简化分析过程，减少提取溶剂用量，降低环境污染，即使是复杂的分析物也不牺牲高回收率，已经成为农残SERS检测中首选前处理方法[10]。QuEChERS-SERS已实现溴氰菊酯、毒死蜱和苯甲酸等农残检测，回收率达到90%～120%，该方法也被广泛应用在其他检测分析领域。

2.2 纳米单元表面化学修饰新方法

在纳米单元表面修饰上功能化探针，如无机盐、无机酸或者有机胺等，通过静电作用或共价结合使得复杂体系中目标物分子被选择性地吸附到纳米单元表面，可避免其他物质对目标物的干扰，实现SERS高灵敏、高重现性和选择性检测。该方法与上文提到的基底制备中修饰方法不同，基底制备中是通过修饰某些试剂使得纳米粒子自行组装形成均匀一致、多“热点”区域的纳米结构以提高灵敏性和重现性，而该化学修饰法则是通过在基底上修饰功能化探针使得待测物与基底之间产生静电捕获(ET)或共价结合以提高灵敏性和特异性。ET提供了一种通过库仑吸引将带电待测物拖曳到SERS衬底上的普遍而有效的方法，通过在SERS衬底上修饰某种探针，使得其所带电荷与待测物的电荷相异，产生静电吸附作用，进而实现ET。例如，上海应用技术大学李丹教授等利用银颗粒包裹的聚乙烯微球作为SERS活性基底，通过静电吸附作用，使得修饰半胱胺或巯基丙酸的银颗粒可以实现海水中带相异电荷的农药检测(图4)[11]。共价结合是指纳米金属与某种基团进行组装形成共价键，能够与特异性SERS探针结合捕捉待测物分子。常用的基团如巯基、烷基等形成Au—S、Au—C化学键，Tang等[12]通过Au—S键将单链寡脱氧核苷酸poly(21dA)化学吸附在Au NPs上获得poly(21dA)-AuNPs结构，并组装在二氢硫酸修饰的硅片(SH—Si)上形成poly(21dA)-AuNPs@SH-Si探针，用于蓖麻毒素的检测，检测限低至8.9 ng·mL-1，该方法为现场快速可靠地检测活性蓖麻毒素提供了良好的应用前景。

图4 包裹在聚乙烯微球的银颗粒上修饰半胱胺或巯基丙酸检测海水中带相异电荷农药

2.3 农残SERS光谱高效获取新结构

在空芯光纤、毛细管等内部吸附纳米颗粒形成膜层结构，并通过一定的工艺技术控制颗粒的沉积厚度。工艺技术常采用硅烷偶联法[13]，即将正硅酸乙酯(TEOS)与氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)在不同条件下水解形成二氧化硅溶胶，然后利用各种涂层技术将溶胶涂覆在光纤探针表面，使其表面有机硅烷化，获得不同厚度二氧化硅(SiO2)薄膜。该薄膜表面含有大量的氨基功能单体，可以嫁接多种选择性纳米增强材料，实现金属纳米颗粒在空芯光纤内的组装成膜。待测物通过反应或者吸附与内部表面膜作用而导致光学输出信号改变，从而对其进行定量分析。这种通过借助空芯光纤、毛细管等材料将纳米粒子转移至内部而形成的内镀金属纳米粒子结构的SERS检测系统，和以往直接基于活性基底表面的SERS检测方法相比，该方法可增加光物相互作用体积，提高拉曼散射光收集效率，进而提升SERS信号强度，实现高灵敏痕量检测。Gao等[14]提出了一种基于悬浮芯微结构空芯光纤(MHF)的光流控表面增强拉曼光谱(SERS)传感器，利用独特的内部结构，通过化学键合将具有SERS效应的银纳米颗粒固定在MHF中，如图5所示。为了证明该结构的可行性，选择R6G、头孢曲松作为分析物，检出限分别为10-14和10-6mol·L-1。这种具有光流控的光纤SERS传感器，可以与芯片设备集成而无需空间光耦合，在医学、食品安全以及生物纤维传感等方面有广泛的应用。该结构为研究高灵敏的SERS检测提供了一种新的手段。

图5 光纤内光流控SERS检测装置示意图，插图是未修饰AgNPs的MHF端面

2.4 农残SERS基底状态转换新过程

从基底的状态出发，SERS检测方法主要包括以下几种。一种是直接基于溶液的SERS检测，称为湿态法。该方法中拉曼探针与胶体粒子混合，在SERS测量前通过加入外部介质诱导粒子聚集而产生热点，但是很难实现高灵敏度的SERS检测。另一种是利用胶体纳米颗粒形成固体薄膜进行SERS检测，称为干态法。干态法在灵敏度上虽优于湿态法，但由于激光照射基底的时间较长，基底受到损伤，导致检测的重现性和稳定性较差。为了解决这一难题，有研究小组提出了动态表面增强拉曼光谱(D-SERS)法[15]，是基于湿态到干态的状态转换纳米颗粒增强拉曼光谱(STNERS)法，此过程会形成一个粒度分散性最小且粒子间距离均匀性最大的三维(3D)热点结构，该结构中每两个相邻粒子之间保持热点，使待测物的SERS信号强度稳定性提升。Weng等[16]采用D-SERS以半胱胺修饰的金纳米棒(AuNRs-cys)为基底，对水稻样品中乙酰甲胺磷残留在100.2～0.5 mg·L-1范围内的光谱进行测量，如图6所示。最低可以检测到0.5 mg·L-1的残留，该方法克服了乙酰甲胺磷分子对金表面的弱亲和力，实现巨大而稳定的增强。

图6 使用D-SERS和AuNRs-cys结合多变量方法检测大米中乙酰甲胺磷的示意图

3 农残SERS光谱智能分析技术

拉曼光谱技术在实现超灵敏痕量检测的同时，也面临着由背景、检测环境变化和设备参数差异等多种干扰因素导致的光谱信噪比低、基线漂移、微弱信号被荧光背景湮灭等问题。此外，采用传统的光谱技术进行定性和定量需要借助专业人员，这种分析方法具有个体差异性、费时费力等不足，不适合应用推广。化学计量学方法通过建立智能分类或回归模型可以在无需专家的情况下实现自动快速光谱分析。基于此，光谱技术结合化学计量学方法可避免或减弱以上问题，进而提升检测结果的准确性和效率。常用的方法包括光谱预处理、特征提取、建模方法等。

3.1 光谱预处理

为了降低或去除拉曼光谱在采集过程中受到外界杂散光、设备系统和样品等因素造成的背景噪声干扰，获取待测物的高质量光谱信息，有必要对光谱进行预处理。常采用的方法有多元散射校正(MSC)、主成分分析(PCA)、小波变换(WT)以及标准正态变换(SNV)等。Zhu等[17]采用SERS技术结合化学计量学开发一种用于定性和定量分析茶叶中毒死蜱残留量的快速，低成本，灵敏的方法。制备具有高增强系数的Au@AgNPs为增强基底，并采用SNV、一阶导数和二阶导数预处理方法对光谱数据进行预处理，以消除基线漂移、随机噪声和散射效应。再将数据分别结合K-近邻(KNN)和遗传算法-偏最小二乘(GA-PLS)建立分类、回归模型进行预测。其中，KNN模型具有较高的分类正确率(90.84%～100%)；GA-PLS模型展现了极好的回归质量，具有较高的相关系数(r=0.96～0.98)；均具备较低的预测均方根误差(RMSEP=0.29，0.31)。该方法将是对茶叶样品中毒死蜱残留进行分类和定量的更有效和强大的工具。

3.2 特征提取方法

虽然SERS光谱经过预处理后，减小了噪声干扰，降低或消除了荧光背景。但是由于SERS光谱数据高达上千维数，且包含冗余信息较多使得后续分析的计算复杂度增加、准确率降低和模型稳健性差。为了优化模型并提高其预测精度，通常不采用全谱变量建模，而是选取特征范围光谱进行分析处理，提取出贡献率较高的变量进行建模。常用特征提取方法有非负因式分解(NMF)、离散余弦变换(DCT)、主成分分析(PCA)等，这些方法通过对光谱信号变换后，从数学变换的意义上获得主体信息。另外，也存在有些方法通过对物质拉曼光谱的变量进行直接选取，这类方法被称为变量选择方法。其中最简单的方法是人工截取，根据物质拉曼光谱归属信息选取特征范围，但是过分依赖操作人员的经验会导致优化结果不可控。因此，一些自动选择算法如竞争性自适应重加权法(CARS)、无信息变量消除(UVE)、GA和随机蛙跳(Random Frog)等被用于变量选择，它们能够自动截取谱峰，不依赖专人的经验知识，简单高效。本人所在研究团队将SERS技术与化学计量学方法结合检测小麦籽粒中残留的矮壮素[7]，采用包含径向基函数(RBF)的核主成分分析(KPCA)对653～683，705～728和847～872 cm-1范围的光谱进行主要特征提取，并讨论了不同核函数宽度(σ)的影响，如图7所示。然后，采用支持向量机回归(SVR)算法建立回归模型预测小麦籽粒中矮壮素残留，交互验证均方差(RMSECV)评估模型性能，结果见表1。

图7 KPCA的σ为1 000(a), 5 000(b), 8 000(c)和10 000(d)的前两个主成分分数散点图

表1 使用化学计量学方法建立模型的预测结果

从表1可知，多元线性回归(MLR)和PLSR所建线性模型的RMSECV值较高，可能导致预测结果的准确率较低；当σ为1 000时，KPCA结合SVR所建模型的预测性能最差，而σ为10 000时预测性能有所提升，但比σ为5 000和8 000时的仍较弱。综上，σ为8 000的KPCA结合SVR所建模型是最佳模型，其RMSECV为0.026 8 mg·L-1，误差较小，能够实现小麦籽粒中矮壮素残留量的准确预测，结果如图8所示。

图8 σ为8 000的KPCA结合SVR所建最佳模型的预测误差

3.3 建模方法

现阶段，虽然研究人员多利用化学计量学方法进行光谱预处理、复杂体系中有效信息快速提取及物质信息的特征分类、含量信息获取等，继而解析物质信息。然而，该过程需人为进行特征提取，存在明显的个体差异、处理流程繁杂，难以获得全局特征，且所构建模型适合小样本，无法处理大规模的数据。近年来，以全连接网络、多层感知网络、深度置信网络、卷积神经网络以及循环卷积神经网络为代表的深度学习方法，由于强大的特征学习能力、易扩展的网络结构以及优秀的稳健性，在目标检测、图像分析、语音识别及语义解析方面得到广泛应用[19]。一些学者也将深度学习方法引入到 SERS光谱分析中，该方法能够从复杂的光谱数据中自动提取出有效的特征结构，时间成本低、鲁棒性强，在农残SERS检测中取得了较好的分析结果。加利福尼亚大学Regina Ragan教授等[20]将卷积神经网络结合 SERS 用于罗丹明量化分析模型构建，实现对1 nmol·L-1～10 fmol·L-1浓度罗丹明的准确分析，模型的交叉验证决定系数达到0.95。Weng等[16]利用轻型级联式深度学习网络-主成分网络对大米中0.5～100.2 mg·L-1乙酰甲胺磷残留进行回归分析，回归模型的R2为0.9164，RMSEP为8.4791 mg·L-1。

4 结论与展望

SERS具有检测灵敏度高、操作简单、成本低等优点，作为一种快速检测农药残留的方法具有很大的发展潜力。本文主要综述了SERS在农残检测中的研究进展，具体包括SERS增强基底的制备、SERS的检测方式优化以及SERS光谱数据的智能解析，可为研究人员对于SERS的应用及发展前景提供一定的借鉴。由于农药种类繁多、结构复杂，使得SERS在分析农药时面临较大的背景干扰，未来应对SERS光谱数据分析方法有更深入的研究，实现可独立于专业人员的农残快速准确检测。另外，SERS技术作为一种强大的分析手段在生物、医学等领域得到了广泛应用，尤其是对人体中肿瘤标志物、蛋白酶、生理指标物和毒物等的检测，为临床诊断提供了数据支撑。然而，由于人体中成分多样、复杂、痕量，为实现快速准确检测，需对样本前处理、待测物富集及特异性捕获等方法做进一步探索。