单增李斯特菌在乳粉中的生存特性

王海艳，石新华，蒙 嵘，李 昕，李凤利，张小玲，盛万里

（1.呼和浩特海关，内蒙古呼和浩特 010020；（2.内蒙古自治区农牧业技术推广中心，内蒙古呼和浩特 010010）

李斯特菌病是由单增李斯特菌引起的食源性疾病，具有较高的致死率，对婴幼儿、老年人和免疫力低下的人危害更为严重，因此单增李斯特菌被列为重要的食源性病原体[1]。单增李斯特菌在自然环境中分布广泛，几乎存在于所有食品中[2]。现已证实乳制品、肉类、蛋类、禽类、海产品、蔬菜等都是李斯特菌的感染源。该菌抵抗力很强，能够耐受低pH 和高盐环境，并且适宜生长的温度范围较宽。目前虽然不可能从食品中将该菌彻底清除，但可以通过有效的卫生防制措施降低其在食品中污染水平，从而降低食品污染事件的发生风险。

单增李斯特菌是乳粉中常见的致病菌之一。为了解其在乳粉中的生存特性，本研究将单增李斯特菌添加到不同水活性（Aw）的干乳粉、复水乳粉和热冲调乳粉中建立不同的乳粉模型，然后对其生存特性进行研究，以期为乳粉中单增李斯特菌风险评估和关键控制措施制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤、牛津琼脂、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂、缓冲蛋白胨水等，购自北京陆桥有限公司；单增李斯特菌标准菌株（54002、54003、54004、ATCC19111 和 ATCC19112），购自中国药品生物制品检定所和上海汉尼有限公司；试验用乳粉，为本室保存。主要仪器包括生物安全柜、恒温培养箱、恒温水浴锅、冰箱、pH 计、菌落计数器等。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养和计数 将单增李斯特菌不同菌株复活后，接种于胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂斜面，37 ℃培养18 h 后作为储备菌；从储备菌中挑取菌落接种于10 mL 胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤，37 ℃培养18 h，连续培养3 次后，等量混合各菌株，用蛋白胨水连续稀释细菌混合物，取0.1 mL 用OXA平板计数。

1.2.2 不同Aw 干乳粉中单增李斯特菌生存特性

1.2.2.1 干乳粉制备 在无菌条件下，将经检验无单增李斯特菌污染的乳粉置于55 ℃烘箱作用20 h进行烘干。

1.2.2.2 不同Aw 调制 将制备的乳粉分别放置于Aw 为0.81（含有饱和硫酸铵水溶液）、0.92（含有饱和硫酸锌水溶液）和0.96（含有饱和硫酸钾水溶液）密封罐中作用12 h，制成3 种Aw 乳粉用于人工接种试验。

1.2.2.3 人工接种细菌 称取制备的不同Aw 乳粉10 g 放入不同瓶中，按103cfu/g 的量将单增李斯特菌混合物加入其中并混匀，上面再覆盖10 g相同Aw 的乳粉，然后密封。同时，按上述同样方法制备原乳粉接种模型作对照。

1.2.2.4 细菌数量监测与分析 将制备的乳粉模型分别置于4 ℃和25 ℃，定期取适量乳粉用缓冲蛋白胨水作10 倍系列稀释后，再接种牛津琼脂平板培养24 h 计数，并对数量变化取对数后进行变化趋势分析。

1.2.3 复水乳粉中单增李斯特菌生存特性

1.2.3.1 不同温度 将不含单增李斯特菌的乳粉与灭菌水按约1 g/6 mL 混合制成复水乳粉（14 g乳粉+86 mL 水）[1]，然后接种单增李斯特菌混合物（102cfu/mL），混匀后分别置于-1.5 ℃、4 ℃、8 ℃、室温（18～25 ℃）、30 ℃、37 ℃、45 ℃培养，分别在24、48、72 h取培养物进行10倍系列稀释后，接种牛津琼脂平板培养24 h 计数。

1.2.3.2 不同pH 将制备的复水乳粉分别调节pH 为4.0、4.4、5.6、6.2、6.8、8.0、9.4，并分别接种单增李斯特菌混合物（102cfu/mL），混匀后分别置于4 ℃和30 ℃下培养；24、48、72 h 后，再分别取培养物进行10 倍系列稀释，接种牛津琼脂平板培养24 h 计数。

1.2.3.3 数据处理 将监测的细菌数量取对数后进行变化趋势分析。

1.2.4 乳粉中单增李斯特菌热耐受性

1.2.4.1 培养基质制备 将不含单增李斯特菌的原料乳粉和高糖高脂乳粉分别用60 ℃灭菌水按约1 g/6 mL 冲调，然后各取2 管，每管10 mL，置于60 ℃水浴中恒温，同样恒温两管10 mL 灭菌水。

1.2.4.2 细菌接种 按照107cfu/mL 的接种量将单增李斯特菌混合物分别添加于恒温60 ℃冲调的原料乳粉、高糖高脂乳粉以及灭菌蒸馏水中，60 ℃分别作用5 min 和10 min。

1.2.4.3 菌量计数及数据分析 分别取经热处理的3 种接种物进行10 倍系列稀释后，接种牛津琼脂平板培养24 h 计数，将计数结果取对数后分析细菌衰减速率。

2 结果与分析

2.1 不同Aw 干乳粉中单增李斯特菌生存特性

2.1.1 4 ℃条件下 单增李斯特菌在Aw=0.96 的乳粉中能够缓慢生长，而在Aw=0.81、Aw=0.92以及原乳粉中生长活力减退，但数量增减差异较小，均保持在103cfu/g 的水平（图1），说明单增李斯特菌在低温条件下的乳粉中能够长期保持活力，且在较高Aw 时还会增长。

图1 不同Aw 干乳粉中单增李斯特菌4 ℃条件下数量变化趋势

2.1.2 25 ℃条件下 4 种Aw 乳粉中单增李斯特菌生长活力很快减退，经过25 d，直接取样进行细菌计数不能检测到单增李斯特菌，只有经过增菌培养复苏后才能够检测到（图2），说明干乳粉中的单增李斯特菌在25℃温度下处于亚损伤状态，会抑制单增李斯特菌的生长。

图2 不同Aw 干乳粉中单增李斯特菌25 ℃条件下数量变化趋势

2.2 复水乳粉中单增李斯特菌生存特性

2.2.1 不同温度 复水乳粉中单增李斯特菌可生长的温度范围为-1.5～37 ℃，-1.5 ℃时生长缓慢，随着温度升高生长速率加快，37 ℃时生长速率最快且在48 h 内可达对数生长最大值，但45 ℃时只存活24 h（图3），说明单增李斯特菌对高温的耐受性很小。

图3 不同温度下复水乳粉中单增李斯特菌数量变化趋势

2.2.2 不同pH 在复水乳粉中，单增李斯特菌可适应pH4.4～8.0 的环境，且在低温（4℃）条件下对酸碱的耐受能力高于高温（30℃）条件下的耐受能力（图4）。

图4 不同pH 下复水乳粉中单增李斯特菌数量变化趋势

2.3 热冲调乳粉中单增李斯特菌对热耐受性

单增李斯特菌在热蒸馏水中的衰减速率最快，而在热冲调的原料乳粉中衰减速率较慢，在热冲调的高糖高脂乳粉中衰减速率更慢（图5），说明乳粉中的单增李斯特菌对热有耐受性，且高糖高脂成分可增强其对热的耐受能力。

图5 单增李斯特菌在3 种不同基质中的衰减速率比较结果

3 讨论

单增李斯特菌广泛分布于环境之中，由于其胞壁质上有大量、以多样形式镶嵌的表面蛋白，所以与其他革兰阳性菌不同，它具有很强的抵抗力，能适应多种环境并在这些环境下复制、增殖和存活。许多资料表明，某些食品中的单增李斯特菌与其他无芽孢的食源性病原菌（如沙门菌和致病性大肠杆菌）相比热耐受性更强[3]，且其热耐受性受诸多因素影响，如培养时间、培养条件及食品特征（盐浓度、Aw、糖和脂肪）等[4]。乳粉是单增李斯特菌生长繁殖的良好基质，在乳粉加工的诸多环节中，如果卫生条件不合格或消毒不彻底，乳粉受到该菌污染的可能性较大，存在食源性单增李斯特菌病暴发的危险。

本研究尽量模拟乳粉可能贮存的冰箱温度（4 ℃）和室温（25 ℃），通过人工方法将单增李斯特菌添加于不同Aw 的干乳粉中，评估单增李斯特菌在不同温度条件下的生长与存活特性，初步了解了干乳粉中单增李斯特菌的生存特性。另外，复水奶粉中的单增李斯特菌能够生长温度为-1.5～37 ℃，在接近中性pH 范围内的复水奶粉中，单增李斯特菌在高温条件下比在低温条件下生长快，但在低温条件下，单增李斯特菌对酸碱的耐受程度比在高温条件下要大，在复水的高糖高脂奶粉中比在原料奶粉中衰减得慢，复水乳粉中的单增李斯特菌生存情况研究结果与Gay 等[5]的研究结果一致。复水奶粉如果污染单增李斯特菌，在低温条件下贮存则能够控制单增李斯特菌生长。

本研究建立冲调乳粉模型，对单增李斯特菌热耐受性进行分析，结果发现乳粉中单增李斯特菌的热抵制能力明显高于蒸馏水中的单增李斯特菌，而高糖高脂成分可提高单增李斯特菌的热抵制能力。因此乳粉冲调时，在不影响乳粉营养成分的情况下，尽可能提高乳粉的冲调温度。乳粉作为即食食品，其食用方法一般在40～70 ℃左右冲调饮用，但建议将冲调好的乳粉充分加热一段时间后再饮用，以达到充分灭菌的效果。