癌痛消方对缺氧肝癌细胞血管生成拟态的影响

黄覃凤，张永琴，梁丽英，杨继峰，韦艾凌

（1.广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530023；2.广西中医药大学，广西南宁530200）

肝癌是消化道常见的恶性肿瘤之一。据2020年美国癌症协会公布的癌症数据显示，肝癌患者病例数的增长最为迅速，在2006年至2017年期间每年以2%～3%的速度增加［1］。与此同时，肝癌也是导致癌症死亡的第三大原因［2］。近年研究发现肝癌细胞中存在血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM），具有VM形成的肝癌较容易发生血行转移，恶性程度高且预后较差。肝癌对人类的生命产生极大威胁，如何有效阻断肿瘤的生长转移是提高肝癌诊治水平的关键。本课题组长期致力于肝癌的中西医结合防治研究，在国内首次提出肝癌“瘀”“毒”“虚”新病机理论假说，并据此研制出癌痛消方应用于临床防治原发性肝癌，疗效显著［3］。

癌痛消方由白花蛇舌草、解毒草、煅牡蛎、延胡索、香附、三棱、党参、半枝莲、黄芪、莪术等组成，具有清热解毒、化瘀散结、健脾益气、行气止痛之功效。本实验采用二氯化钴（CoCl2）诱导体外培养肝癌细胞株HepG2缺氧模型，观察癌痛消方含药血清对肝癌细胞VM成管能力的影响，采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测VM形成相关因子的表达水平，探讨癌痛消方拮抗肝癌的作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞株人肝癌细胞株HepG2（由中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库提供）。

1.2 动物清洁级SD大鼠，雄性，体质量250～300 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物生产/使用许可证号：SCXK（湘）2014-0011。动物均饲养于室内温度（20～25℃）、相对湿度为55%～70%的动物实验室。

1.3 药物癌痛消方由白花蛇舌草20 g、解毒草20 g、三棱10 g、半枝莲15 g、煅牡蛎30 g、香附10 g、党参10 g、黄芪20 g、绞股蓝12 g、莪术10 g、延胡索20 g、炙甘草10 g组成，制剂由广西中医药大学第一附属医院分子生物实验中心配制，为癌痛消方的饱和溶液，浓度为1 g/ml（用药剂量按人与动物体质量换算）。

1.4 试剂胎牛血清（美国Gibco公司，批号：25200-056）；RPMI 1640培养液（美国Gibco公司，批号：SV30010）；CoCl2（美国Sigma公司，批号：G7021）；兔抗HIF-1α多克隆抗体（美国Proteintech公司，批号：20960-1-AP）；兔抗VEGF多克隆抗体（美国Protein⁃tech公司，批号：19003-1-AP）；兔抗EphA2单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号：6997S）；兔VE-cadherin单克隆抗体（美国Cell Signaling Tech⁃nology公司，批号：2500S）；鼠抗β-actin单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：TA-09）。

1.5 仪器DMI6000B型倒置荧光显微镜（德国，Lei⁃ca公司）；Forma 370二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；Mini-PROTEAN蛋白垂直电泳系统（美国Bio-Rad公司）；Amersham Imager 600多功能成像仪（美国GE公司）。

2 方法

2.1 含药血清的制备将SD大鼠随机分成4组，每组6只。癌痛消方高、中、低剂量组分别按临床剂量等效量的2倍、1倍、0.5倍（即10.8 g/kg、5.4 g/kg、2.7 g/kg）灌胃给药，正常组予蒸馏水灌胃，每日2次，连续灌胃7 d，末次给药后2 h，以相同的剂量重复给药1次，1 h后以戊巴比妥麻醉，75%酒精消毒，腹主动脉取血，常温中静置2 h后3 000 r/min离心20 min，合并所得同组动物血清，使用0.22 µm滤器过滤后即为癌痛消方含药血清，经56℃、30 min水浴的灭活操作后，置于-80℃冰箱，保存备用。

2.2 细胞培养将HepG2接种于含10%胎牛血清、100 g/L青霉素、100 g/L链霉素的RPMI-1640完全培养液中，置于37℃、5% CO2培养箱内培养；待细胞贴壁生长至单层后更换为含150µmol/L CoCl2的完全培养液，再培养24 h。

2.3 血管生成拟态结构观察将基质胶（Matrigel）按每孔200 µl加入24孔板备用。培养HepG2至70%~80%融合，胰酶消化。加入含10% FBS的DMEM培养基，调整HepG2细胞浓度为1×105cell/ml，每孔取0.8 ml。加入不同浓度的癌痛消方含药血清，置于37℃和5%CO2浓度的培养箱中培养24 h。倒置荧光显微镜下观察VM成管情况，拍照并获取图像。计算细胞血管生成拟态形成率，即一个视野里具有血管生成拟态功能细胞与所有细胞的百分比。

2.4 Western blot检测相关蛋白表达收集细胞，滴加RIPA裂解液，裂解细胞，提取细胞的总蛋白；BCA法检测总蛋白的浓度，滴加SDS-PAGE上样缓冲液，经10 min沸水浴后，按照50 µg的上样量置于PAGE凝胶电泳分离目的蛋白。电泳结束后使用半干法（25 V恒压45 min）将所得蛋白转印至PVDF膜，再使用脱脂乳在室温中封闭1 h。分别加入稀释后的HIF-1α、VEGF、EphA2、VE-cadherin抗体，4℃孵育过夜。TBST洗涤PVDF膜3次，每次5 min，随后滴加辣根过氧化物酶标记（HRP）的山羊抗兔IgG抗体，37℃中孵育1 h。TBST洗涤3次后再使用ECL发光液进行显影，拍照保存结果。使用Image J软件计算各目的条带和内参β-actin的灰度值，以所得两者的灰度值比值作为蛋白表达量。每个实验均重复3次，取平均值。

2.5 统计学方法采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析及作图，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间差异采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 癌痛消方对HepG2肝癌细胞血管生成拟态的影响见图1、图2、表1。与正常组比较，癌痛消方各剂量组HepG2细胞血管生成拟态形成率均明显下降，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），说明癌痛消方各剂量组均可抑制肝癌VM的形成。

表1 各组HepG2细胞血管生成拟态形成率比较（±s）

表1 各组HepG2细胞血管生成拟态形成率比较（±s）

注：与正常组比较，①P<0.05，②P<0.01

图1 各组肝癌细胞血管生成拟态显微结构（×40）

图2 各组HepG2细胞血管生成拟态形成率比较

3.2 癌痛消方对HepG2肝癌细胞中VM形成相关因子蛋白表达的影响见图3、图4、表2。与正常组比较，癌痛消方各剂量组HIF-1α、VEGF、VE-cadherin、EphA2蛋白表达水平明显下降，均具有统计学差异（P<0.05或P<0.01）。

图3 Western blot检测各组肝癌细胞HIF-1α、VEGF、EphA2、VE-cadherin蛋白的表达图

图4 各组肝癌细胞HIF-1α、VEGF、VE-cadherin、EphA2蛋白的表达水平

表2 各组肝癌细胞HIF-1α、VEGF、VE-cadherin、EphA2蛋白表达水平比较 （±s）

表2 各组肝癌细胞HIF-1α、VEGF、VE-cadherin、EphA2蛋白表达水平比较 （±s）

注：与正常组比较，①P<0.05，②P<0.01

4 讨论

肝癌为典型的富血管恶性肿瘤，高密度的血管形成不但是肝癌生长及转移复发的诱因，而且还是肝癌组织营养供给的主要途径。VM作为不依赖于内皮细胞的管道，肝癌的组织可经过这些血管和宿主的管道相连接，从而为肝癌的生长、转移及侵袭提供丰富的血供。肿瘤的快速增长及血供量不足会导致微环境中出现缺氧，然而缺氧并未能阻止肿瘤的恶性增长。缺氧状态的短暂或是持久都可增加恶性肿瘤预后不佳的风险，即通过调节相关肿瘤细胞通路、促进肿瘤细胞分化、诱导和维持肿瘤干细胞形成，从而促进肿瘤进展，同时还可以增加肿瘤细胞的耐药性，促进血管生成和VM［4］。刘文斌等［5］研究结果显示，无论是常氧或缺氧状态，肝癌细胞均能形成VM管道，但缺氧组的肝癌细胞所形成的管道长度明显比常氧组的长，这说明缺氧微环境有利于肝癌VM的形成；同时该研究还发现，在缺氧微环境下，伴随VM管道的生成，缺氧诱导因子（hypoxia-in-ducible factor，HIF-1α）可在缺氧条件下被明显上调。HIF-1α作为主要的转录调控因子，可以上调其下游血管内皮生长因子（vascularen⁃dothelial growth factor，VEGF）的转录［6］，从而促进VM网络状结构的形成［7］。VEGF还可以通过提高肿瘤血管的通透性，促使外渗的血浆蛋白增多，从而为VM的形成及新生血管生成提供暂时性基质。此外，VEGF还能促进促红素人肝细胞受体酪氨酸激酶A2（Ephreceptor tyrosine kinase-type A2，EphA2）和血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）的表达，从而促进VM的形成［8］。

肝癌归属于中医学“积聚”的范畴，中医药治疗肝癌有着悠久的历史，且疗效显著。大量临床及实验研究均证实，临床经验方在治疗肝癌方面可改善患者的生活质量，延长生存时间，减毒增效，增强患者免疫力，缓解射频消融术后常见的不良反应等［9-10］。本课题组提出的肝癌“瘀”“虚”“毒”新病机理论假说认为：癌毒是致病的始动因素，毒湿结聚、气血运行不通是肝癌的发病基础，湿、瘀、热为病理产物，虚既为病之因也为病之进。癌痛消方正是基于此病因病机，在《医林改错》的“膈下逐瘀汤”中加入临床经验用药而形成的方剂。前期研究表明，该方治疗肝癌及其术后复发者临床疗效确切，无明显毒副作用［11］，且可抑制肝癌细胞的增殖并促使其凋亡［12］，抗肿瘤血管新生［13］。

本次实验研究发现，癌痛消方可明显抑制肝癌细胞血管生成拟态的形成，能降低肝癌血管生成拟态相关因子HIF-1α、VEGF、EphA2、VE-cadherin的蛋白表达水平。本研究结果可为癌痛消方抗肝癌的临床应用提供新的科学依据。