表没食子儿茶素没食子酸酯全乙酰化衍生物对人口腔鳞癌耐药细胞增殖及多药耐药性的影响

韦艳，张海英，欧冰凝，梁钢

（1.武警广西总队医院，广西南宁530000；2.广西医科大学，广西南宁530022）

表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gal⁃late，EGCG）是茶多酚的主要组成成分，其结构中含有多个邻位羟基而具有较强的抗氧化性，已有大量的实验研究证明EGCG不仅具有抗肿瘤活性，并且对肿瘤的多药耐药性有逆转作用。但由于EGCG结构不稳定，易发生氧化，生物利用度低，制约了其应用价值。本课题组通过乙酰化反应后进行结构修饰得到表没食子儿茶素没食子酸酯全乙酰化衍生物（Ac-EGCG），增加了其化学稳定性。前期研究发现Ac-EGCG体外有较好的抗肿瘤及逆转多药耐药性的作用［1-2］，本研究观察Ac-EGCG对人口腔鳞癌耐药细胞增殖的影响，并检测Ac-EGCG作用于人口腔鳞癌耐药细胞后对多药耐药1型基因（MDR1）、肺耐药蛋白（LRP）、谷胱甘肽转移酶（GST-π）、DNA拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）各多药耐药相关基因表达的影响，探讨其逆转肿瘤多药耐药性的可能机制。

1 实验材料

1.1 细胞株人口腔鳞癌细胞KB及其耐药株KBV200保存于广西医科大学实验中心。人口腔鳞癌细胞KB及其耐药株KBV200置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基培养，KBV200细胞培养时加入200 ng/ml长春新碱（VCR）维持其多药耐药性。

1.2 药品与试剂Ac-EGCG由本研究团队合成（纯度98.77%）；胰蛋白酶与牛血清购自美国Hyclone公司；Model-450酶联免疫检测仪（美国Bio-Rad公司）；实时定量PCR仪（ABI PRISM7900 system，美国Ap⁃plied Biosystems公司）。

2 方法

2.1 甲基四唑蓝（MTT）法检测Ac-EGCG对耐药细胞的抑制作用分别取对数生长期的人口腔鳞癌耐药细胞，稀释，调整单细胞悬液为1×105cell/ml，接种于同一96孔板中，每孔100µl，置37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜。将Ac-EGCG配制成不同浓度（60 mg/L、120 mg/L、240 mg/L、480 mg/L、960 mg/L）的系列溶液，每个浓度设4个复孔；对照组加入等量无血清RPMI 1640培养液。培养48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20µl，继续培养4 h，终止培养，弃培养液，每孔加入150 µl DMSO振荡10 min，充分溶解蓝紫色结晶，以酶标仪于492 nm处测定吸光值，实验不同日重复测定3次取均数。计算各组细胞抑制率（IR）=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%。根据对应的抑制率用LOGIT软件计算IC50（50%的细胞株生长受抑制时所需的药物浓度）和IC10（10%的细胞株生长受抑制时所需的药物浓度）。

2.2 MTT法检测Ac-EGCG对细胞耐药的逆转作用实验设空白对照组、阴性对照组、药物组。取人口腔鳞癌耐药细胞单细胞悬液1×105cell/ml种板，空白对照组仅加培养液，阴性对照组加入浓度梯度（0.5 mg/L，1 mg/L，1.5 mg/L，2 mg/L）的VCR（无Ac-EGCG作用耐药细胞），药物组选取3个对耐药细胞株抑制率<10%的Ac-EGCG浓度（20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L）为试验浓度，分别联合浓度梯度的VCR（0.5 mg/L，1 mg/L，1.5 mg/L，2 mg/L）。按前述MTT实验方法，LOGIT软件计算各组VCR的IC50。逆转耐药倍数（reverse fold，RF）=VCR的IC50/联合Ac-EGCG后VCR的IC50。

2.3 实时定量PCR检测MDR1、GST-π、TopoⅡ、LRP基因的表达实验分为阴性对照组和实验组两组。阴性对照组（KBV200组）：该组仅有KBV200细胞，不加药物干预。实验组（KBV200+Ac-EGCG组）：于KBV200细胞中加入98.2 mg/L Ac-EGCG培养48 h。引物以及PCR微阵列由上海康成生物工程有限公司提供。各样品在5 ml EP管中配制混合液：2×Super Ar⁃ray PCR mastermix 550 µl，已 稀 释 的cDNA102 µl，ddH2O 448 µl，总体积1 100 µl。加10 µl混合液到PCR微阵列对应的每个孔中，在设置PCR程序前将准备好的PCR微阵列放在冰上，所设置的程序如下：10 min 95℃，15 s 95℃，1 min 60℃（收集荧光）40个循环。所有样本做3个复孔，实时定量PCR产物用融解曲线进行分析以排除是否有引物二聚体的干扰。反应设阴性对照（超纯水代替引物及模板），以达到阈值的最低循环数（Ct值）计算样本中基因的mRNA拷贝数相对量。采用ΔΔCt方法计算每个处理组中的每个通路反应孔相关基因ΔCt。ΔCt（对照组）=对照组平均Ct值-对照组看家基因平均Ct值；ΔCt（实验组）=实验组平均Ct值-实验组看家基因平均Ct值。两组差异基因ΔΔCt=ΔCt（实验组）-ΔCt（对照组），通过2-ΔΔCt计算实验组与对照组对应基因的表达差异倍数，差异倍数大于2为差异基因。

2.4 统计学处理采用SPSS 16.0软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间均数的比较采用t检验，P<0.05表示差异有显著性意义。

3 结果

3.1 Ac-EGCG对人口腔鳞癌耐药细胞增殖的影响不同浓度Ac-EGCG（60 mg/L、120 mg/L、240 mg/L、480 mg/L、960 mg/L）对KBV200作用48 h的抑制率（%）分别为：（5.56±0.11）%、（13.34±0.38）%、（18.70±0.59）%、（35.19±0.51）%、（67.10±0.24）%，随着Ac-EGCG浓度增加，对KBV200的抑制率增加（P<0.05），呈浓度依赖性。Ac-EGCG对KBV200作用48 h的IC50为609.5 mg/L，IC10为98.2 mg/L。

3.2 Ac-EGCG对人口腔鳞癌耐药细胞耐药性的影响20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L Ac-EGCG对VCR的逆转倍数为1.38、2.12、3.26倍（P<0.05），随着Ac-EGCG浓度增加，对KBV200耐药逆转作用增加（P<0.05），呈浓度依赖性。见表1。

表1 Ac-EGCG对人口腔鳞癌耐药细胞耐药性的影响 （±s）

表1 Ac-EGCG对人口腔鳞癌耐药细胞耐药性的影响 （±s）

注：与阴性对照组比较，①P<0.05；与20 mg/L Ac-EGCG组比较，②P<0.05；与40 mg/L Ac-EGCG组比较，③P<0.05

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3.3 实时定量PCR检测各基因的表达情况见表2。Ac-EGCG可下调人口腔鳞癌耐药细胞KBV200中MDR1、GST-π、TopoⅡ基因的表达，分别下调5.09、2.12、2.46倍（P<0.05）；而对LRP基因表达无影响。

表2 Ac-EGCG对耐药细胞中MDR1、GST-π、TopoⅡ、LRP基因表达的影响 （±s)

表2 Ac-EGCG对耐药细胞中MDR1、GST-π、TopoⅡ、LRP基因表达的影响 （±s)

注：与KBV200组比较，①P<0.05

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4 讨论

本课题组在前期就Ac-EGCG对体外逆转肿瘤多药耐药性进行了研究，现本研究在基因转录水平上进一步探讨Ac-EGCG逆转耐药机制。在MTT法测定Ac-EGCG对人口腔鳞癌耐药细胞增殖及耐药性的实验中，结果表明Ac-EGCG对KBV200的抑制率呈浓度依赖性，随着浓度增加而提高，并且3个低于IC10浓度的Ac-EGCG都能下调长春新碱对KBV200的IC50，增加了KBV200对长春新碱的敏感性，说明Ac-EGCG可逆转KBV200对长春新碱的耐药性。

在检测耐药相关基因表达时发现，Ac-EGCG可下调人口腔鳞癌耐药细胞KBV200中MDR1、GST-π、TopoⅡ基因的表达，而对LRP基因表达无影响。多药耐药1型基因（MDR1）可导致载体转运蛋白P-糖蛋白（P-gp）过度表达，P-gp具有依赖ATP的“药泵”功能，能够增加药物的外向转运而降低细胞内的药物浓度，这是肿瘤经典的耐药途径。目前国内外研究的肿瘤耐药逆转剂多数是针对此机制，所发现的中药类MDR逆转剂绝大多数仍然是P-gp竞争性抑制剂［3-4］。Ac-EGCG可降低MDR1基因的表达，这可能是其逆转耐药的途径之一，至于Ac-EGCG是否可从RNA翻译水平上抑制人口腔磷癌耐药细胞中P-gp蛋白表达还有待下一步的研究。实验还发现Ac-EGCG可下调人口腔磷癌耐药细胞谷胱苷肽-S-转移酶-π（GST-π）基因的表达，GST是体内重要的药物代谢酶体系，GST-s不同同功酶对不同抗肿瘤药物有一定特异性，其中GST-π与肿瘤耐药密切相关，其作用机制可能为：GST催化抗肿瘤药物与GSH结合，直接降低药物活性；或核内GST抑制药物对DNA攻击；或GST催化GSH与DNA竞争与金属铂结合，降低铂类活性；此外，GSH在细胞损伤修复和解毒过程中也具有关键性作用［5-6］。同时，Ac-EGCG可下调人口腔磷癌耐药细胞拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）基因的表达，拓扑异构酶（Topoisom⁃erase）是一种能催化DNA超螺旋结构局部构型改变的基本核酶，许多药物通过该酶与DNA形成共价复合物，引起DNA永久性损伤（DNA断裂），导致肿瘤细胞凋亡。TopoⅡ活性降低、表达减少或基因突变，可使化疗药物丧失靶点产生耐药［7-8］。实验中检测到Ac-EGCG对肺耐药蛋白（LRP）RNA的表达影响不大，但在蛋白表达水平上Ac-EGCG是否通过LRP逆转耐药，值得进一步继续研究。