蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠血脑屏障通透性及紧密连接蛋白的影响

王蔚，杜渊，钟霞，王洪连，孙长侦，沈宏萍，王丽，杨思进

（西南医科大学附属中医医院，四川泸州646000）

脑出血的发病率高，约占我国急性脑血管病的30%，急性期的病死率达到30%～40%，患病后致残率高，对人类健康造成了严重危害［1］。脑出血发生后诸多因素会导致脑组织继发性损伤，脑水肿的形成是该疾病发展过程中的关键环节，其中血脑屏障结构破坏，通透性增加又是脑水肿形成的主要因素之一。紧密连接蛋白中闭锁小带蛋白（ZO-1）、咬合蛋白（Oc⁃cludin）、闭合蛋白-5（Claudin-5）、连接黏附分子-1（JAM-1）与血脑屏障的结构及通透性密切相关。蛭龙活血通瘀胶囊是西南医科大学附属中医医院研制的院内制剂，前期应用于脑出血患者的治疗取得了良好疗效［2］。动物实验亦证实，该药能有效改善脑出血大鼠脑组织水肿［3］。本研究在前期实验的基础上，以自体血注入法复制脑出血动物模型，观察蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠血脑屏障通透性以及脑组织紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5、JAM-1表达的影响，进一步研究蛭龙活血通瘀胶囊防治脑出血的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级SD大鼠108只，雄性，体质量（280±20）g，购于成都达硕实验动物有限公司，动物使用许可证：SYXK（川）2018-065。由西南医科大学实验动物研究中心饲养，环境温度（22±2）℃，湿度30%～40%，投以普通大鼠饲料，自由摄食及饮水。

1.2 药物及仪器蛭龙活血通瘀胶囊由西南医科大学附属中医医院制剂室提供，批准文号：川药字Z20070528；规格：每粒0.4 g；批号：20180216。盐酸法舒地尔注射液为成都菀东药业有限公司产品，规格：每支2 ml∶30 mg；批号：180101。兔抗ZO-1多克隆抗体（Thermo Fisher）；兔抗Occludin多克隆抗体（Gene Tex）；兔抗Claudin-5多克隆抗体（Absin）；兔抗JAM-1多克隆抗体（Novus）；逆转录试剂盒（Thermo scientific）；大鼠脑立体定位仪（北京众实迪创科技发展有限责任公司）；数显恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；BY-400C低速离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；SLFAD自动酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；Thermo 991型-80℃超低温冰箱（美国赛默飞世尔）；IMS-40全自动雪花制冰机（常熟雪珂电器有限责任公司）；KJ201-BS型震荡器（江苏康健医疗用品有限公司）；DYY-10C电泳仪（北京六一仪器厂）；Chemi⁃Doc XRS凝胶成像系统（美国Bio-Rad）；BMZ-3自动组织包埋机（湖北安立信医疗实业有限公司）；Leica石蜡切片机（北京科誉兴业科技发展有限公司）；cx21FS1光学显微照相系统（日本Olympus公司）；Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪（瑞士Roche）。

1.3 造模及模型评估大鼠称重后以400 mg/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，距尾尖0.5 cm处剪断鼠尾，取血50 µl备用。用脑立体定位仪以大鼠俯卧位固定鼠头，常规备皮及消毒后，沿头皮正中纵向切开约10 mm，用30%双氧水腐蚀骨膜使前囟及冠状缝充分暴露，调节定位仪X、Y轴坐标以定位尾壳核区域，使针尖垂直于矢状缝右侧3.0 mm、前囟前0.2 mm处，用三棱针在针尖下钻开颅骨，以颅骨外板为零点调节定位仪Z轴，进针深度为6.0 mm，以5µl/min匀速将血缓慢注入，留针约15 min后缓慢退针，用骨蜡将钻孔封闭，术后头皮常规缝合消毒［4-5］。假手术组大鼠只进针不注血。术后按照“5分制法”对大鼠进行神经功能评分［6］，评分为1～3分则认为造模成功，可纳入实验。

1.4 分组及给药实验大鼠按随机数字表法分为假手术组、脑出血模型组、盐酸法舒地尔组、蛭龙活血通瘀组，每组27只。各组又划分为12 h、48 h、3 d、7 d 4个亚组，其中3 d组动物数为9只，其余3个亚组的动物数为6只。蛭龙活血通瘀组每日按1.2 g/kg灌胃给药，灌胃体积为3 ml；盐酸法舒地尔组腹腔注射，每日剂量为12 mg/kg［7］；假手术组和脑出血模型组均给予同蛭龙活血通瘀组等体积的生理盐水灌胃。

1.5 观察指标

1.5.1 伊文思蓝法检测血脑屏障通透性采用伊文思蓝（evens blue，EB）法进行检测［8］。在实验规定各时点前2 h，大鼠称重麻醉后，经右侧股静脉按20 mg/kg注射2%伊文思蓝。各时点将大鼠深度麻醉后用0.9 %生理盐水迅速经心脏灌注，脱颈处死，剪断鼠头，取出脑组织，冠状位切取损伤周围脑组织，浸泡于装有甲酰胺的试管中，经电子恒温水箱45℃加热水浴24 h，用移液器吸取上清液，置于离心管中，以1 000 r/min离心5 min，吸取1 ml加入酶标板，用酶标仪检测光密度值（OD值）。以OD/g湿脑组织表示脑组织的EB含量。

1.5.2 Western blot检测ZO-1、Occludin蛋白表达大鼠称重后予以腹腔注射10%水合氯醛至深度麻醉，快速取出脑组织，去除软脑膜及表面血液，切取出血侧大脑半球血肿周围脑组织，置于试管中，立即保存至-80℃冰箱。取0.1 g脑组织，用1 ml RAPI裂解液研磨粉碎提取蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，取50 µg总蛋白量进行SDS-PAGE电泳，湿法电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，相应一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤后，HRP酶联二抗常温孵育1 h，TBST洗涤，化学发光法进行信号检测。

1.5.3 免疫组化法观察Claudin-5、JAM-1蛋白表达大鼠术后3 d，给予深度麻醉后分别经0.9%生理盐水、4%多聚甲醛心脏灌注，脱颈处死后，剪断鼠头剥离取出大脑组织，在4%多聚甲醛中固定24 h，经由低到高梯度的乙醇脱水，二甲苯透明，用石蜡包埋制成蜡块，用切片机连续切片，经二甲苯、乙醇常规脱蜡，EDTA修复液、柠檬酸缓冲液高压修复，冷却至室温，甲醇浸泡后PBS缓冲液冲洗，依次经一抗、二抗孵育，PBS冲洗，DAB显色，流水冲洗，苏木素复染，稀盐酸分化，饱和碳酸锂反蓝，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，用中性树胶脂封片。在光学显微镜下观察相应蛋白表达情况。

1.5.4 qRT-PCR法检测Claudin-5 mRNA、JAM-1mRNA水平大鼠在实验规定的时点深度麻醉后，快速取出脑组织，去除软脑膜及表面血液，切取出血侧大脑半球血肿周围脑组织，置于试管中，立即保存至-80℃冰箱。用Trizol法提取总RNA，根据Claudin-5、JAM-1的cDNA序列，由上海生物工程有限公司合成引物。

Claudin-5：上 游5’-GTTAAGGCACGGGTG⁃GCACTC-3’；下 游5’-CGGACTACGATGTTGGC⁃GAACC-3’

JAM-1：上 游5’-GCTGTACGCATGGAGGCT⁃GTG-3’；下 游5’-CCACGGCTATAGGCAAACCA⁃GATG-3’

逆转录后按95℃10 min预变性，40个循环（变性95℃15 s，55℃15 s，72℃30 s）进行Real-time PCR扩增，用荧光定量PCR仪进行常规溶解曲线分析测定CT值，以2-ΔΔCT的计算值作为相对表达水平［9］。

1.6 统计学方法采用SPSS 13.0统计学软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）、多重比较LSD及Dunnett法进行数据分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组EB含量比较假手术组脑组织EB含量各时点均无明显变化（P>0.05）；与假手术组比较，脑出血模型组大鼠EB含量各时点均明显增加（P<0.01），在术后3 d时EB含量增加最为明显，7 d时有所下降；与脑出血模型组比较，蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组大鼠脑组织EB含量在各时点均有明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。见表1。

表1 各组EB含量比较 （OD/g，±s）

表1 各组EB含量比较 （OD/g，±s）

注：与假手术组比较，①P<0.01；与脑出血模型组比较，②P<0.01

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2.2 各组ZO-1蛋白表达比较假手术组大鼠脑组织ZO-1蛋白在各时点均无明显改变（P>0.05）；与假手术组比较，脑出血模型组大鼠脑组织ZO-1蛋白在各时点表达均明显下降（P<0.01），在术后3 d时ZO-1蛋白下降最为明显，7 d时有所回升；与脑出血模型组比较，蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组脑组织ZO-1蛋白表达在各时点均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。见表2。

表2 各组ZO-1蛋白相对表达量比较 （±s）

表2 各组ZO-1蛋白相对表达量比较 （±s）

注：与假手术组比较，①P<0.01；与脑出血模型组比较，②P<0.01

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2.3 各组Occludin蛋白表达比较假手术组大鼠脑组织Occludin蛋白在各时点均无明显改变（P>0.05）；与假手术组比较，脑出血模型组Occludin蛋白在各时点表达均明显下降（P<0.01），在术后3 d时Occludin蛋白表达下降最为明显，7 d时有所回升；与脑出血模型组比较，蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组Occludin蛋白表达在各时点均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。见表3。

表3 各组Occludin蛋白相对表达量比较 （±s）

表3 各组Occludin蛋白相对表达量比较 （±s）

注：与假手术组比较，①P<0.01；与脑出血模型组比较，②P<0.01

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2.4 各组血肿周围组织Claudin-5、JAM-1蛋白表达比较免疫组化结果显示，假手术组大鼠术区脑组织可见大量均匀分布的Claudin-5、JAM-1蛋白表达，其中Claudin-5蛋白主要表达于神经元细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞，形态可呈线条状或短棒状，JAM-1蛋白主要表达于神经元细胞、神经胶质细胞，血管内皮细胞也可见少量表达，形态呈短棒状；与假手术组比较，脑出血模型组大鼠血肿周围组织仅存在少量Claudin-5、JAM-1蛋白表达；与脑出血模型组比较，蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组Claudin-5、JAM-1蛋白表达均明显增加。见图1。

图1 各组大鼠血肿周围组织Claudin-5、JAM-1蛋白表达比较（×400）

2.5 各组大鼠脑组织Claudin-5 mRNA水平比较假手术组大鼠脑组织Claudin-5 mRNA水平在各时点均无明显改变（P>0.05）；与假手术组比较，脑出血模型组大鼠脑组织Claudin-5 mRNA水平在各时点均显著降低（P<0.05），3 d时降低最为明显，7 d时有所回升；与脑出血模型组比较，蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组各时点脑组织Claudin-5 mRNA水平均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表4。

表4 各组大鼠脑组织Claudin-5 mRNA水平比较 （±s）

表4 各组大鼠脑组织Claudin-5 mRNA水平比较 （±s）

注：与假手术组比较，①P<0.05；与脑出血模型组比较，②P<0.05

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2.6 各组大鼠脑组织JAM-1 mRNA水平比较假手术组大鼠脑组织JAM-1 mRNA水平在各时点均无明显改变（P>0.05）；与假手术组比较，脑出血模型组大鼠脑组织JAM-1 mRNA水平在各时点均显著降低（P<0.05），3 d时降低最为明显，7 d时有所回升；与脑出血模型组比较，蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组各时点脑组织JAM-1 mRNA水平均有明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表5。

表5 各组大鼠脑组织JAM-1 mRNA水平比较 （±s）

表5 各组大鼠脑组织JAM-1 mRNA水平比较 （±s）

注：与假手术组比较，①P<0.05；与脑出血模型组比较，②P<0.05

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3 讨论

脑出血后脑组织水肿的机制较为复杂，与诸多因素相关，其中血脑屏障（blood brain barrier，BBB）结构和功能损伤起到了相当重要的作用［10］。BBB是一个复杂的细胞系统，是维持脑组织与血液、脑脊液之间进行物质交换的重要结构。完整的血脑屏障不仅能选择性地使机体所需营养物质、代谢产物通过，以维持脑组织内环境的稳定，而且还能够防止血液中的有害物质进入脑内，以保护脑组织免遭损害。在BBB的构成中，紧密连接（tight junction，TJ）使血管内皮细胞（BMECs）之间封闭，从而防止有害物质通过，维持神经系统的内环境稳定，避免脑组织损伤［11］。研究发现［12］，紧密连接蛋白主要由跨膜蛋白、胞质附着蛋白、细胞骨架蛋白三类组成，它们共同维持BBB的完整性，当其结构和功能发生异常时，即会对BBB通透性造成严重影响［13］。其中，跨膜蛋白又包括咬合蛋白（Occludin）、闭合蛋白（Claudin）和连接黏附分子（junctional adhesive molecule，JAM）三种完整的膜蛋白。Occludin是首个被研究证实的跨膜蛋白，相对分子质量64 000，结构上含有504个氨基酸，4个跨膜结构域，其羧基端与胞质附着蛋白ZO-1相互作用，成为TJ的主要结构蛋白和功能调控蛋白［14-15］。Claudin家族蛋白成员的分子量大小约为20～27 KDa，它们在不同的组织中表达，具有组织特异性，其中Claudin-5主要表达于哺乳动物的脑内皮细胞。有研究表明，Clau⁃din的高表达可以形成紧密连接样结构［16］。JAMS家族蛋白属于免疫球蛋白超家族成员之一，分子量约为45 kDa，是单次跨膜蛋白，其细胞外有二个环状结构，其外侧的环状结构可以与对侧的内皮细胞JAMS构成同源二聚体结构，也可以与不同的免疫球蛋白超家族成员共同形成异元的二聚体结构。JAM-1主要在脑组织中表达［17］。闭锁小带蛋白（zonula occludens，ZO）是首个被证实的胞质附着蛋白，其分布于细胞质内膜的表面，与诸多紧密连接蛋白、细胞骨架相连，属于膜相关鸟氨酸激酶（membrane-associated guanylate ki⁃nase-like proteins，MAGUK）家族成员，包含1个SH3、1个GUK和3个PDZ结构域，ZO-1分布于血脑屏障内皮细胞紧密连接的闭锁小带中，与血脑屏障的通透性密切相关，因此是检测血脑屏障结构和功能的良好指标［18］。

本研究以自体尾部血注入法制备大鼠脑出血模型，通过检测血脑屏障通透性及血脑屏障紧密连接蛋白的表达，研究蛭龙活血通瘀胶囊防治脑出血的作用机制。实验结果表明，脑出血模型组大鼠在术后血脑屏障通透性发生改变，脑组织EB含量明显升高，至3 d时升高最为明显，7 d时有所降低；脑组织ZO-1、Oc⁃cludin、Claudin-5、JAM-1表达明显减少。与脑出血模型组比较，蛭龙活血通瘀胶囊能明显降低脑组织EB含量，改善血脑屏障通透性（P<0.01），明显增加血肿周围组织ZO-1、Occludin、Claudin-5、JAM-1蛋白表达（P<0.01），使Claudin-5 mRNA、JAM-1 mRNA表达水平增加（P<0.05）。由此可见，蛭龙活血通瘀胶囊可能通过上调血脑屏障紧密连接蛋白在脑内的表达，调节血脑屏障通透性，从而起到脑保护作用。