精索静脉曲张患者手术前后MT-COI和MT-COII基因表达的水平变化及对精子的影响分析

梁高照，王茜茜，汪 清

（1深圳市宝安人民医院（集团）泌尿疾病中心 广东 深圳 518000）

（2深圳市宝安人民医院（集团）风湿免疫科 广东 深圳 518000）

精索静脉曲张（VC）是指男性精索中的蔓状静脉丛发生异常扩张、迂曲和延伸，是影响男性生育的主要因素之一。有资料表明[1]，有将近30%的不育症男性患者同时患有VC。VC出现与吸烟、平时生活习惯密切相关，同时过于劳累、长时间进行剧烈运动也可促使疾病发生。由于日常生活中，男性经常处于过度劳累状态，导致其自身植物神经紊乱，精索静脉发生病变，从而出现VC。当前，临床在VC治疗时多采取手术，据有关研究显示[2]，经手术能提升VC患者的精子DNA质量。线粒体DNA氧化受损和多类疾病出现相关，当前有关手术对VC患者基于部分线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ（MT-COI、MTCOII）基因表达水平的影响较少。为此，本文就VC患者术前术后的MT-COI、MT-COII基因表达水平改变和对精子的影响开展分析，现报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选择2020年1月—2021年4月本院本院收治VC患者共64例，年龄25～68岁，平均年龄（56.25±5.30）岁。纳入标准：①患者平静时呼吸其精索静脉最大内径（DR）≥1.8 mm，行Valsalva实验时，其精索静脉最大内径（DV）≥2.0 mm；Valsalva实验结果显示为阳性，实验时频谱和彩色多普勒测及反流信号，且TR≥1 s，需满足以上所有标准才能被确诊为VC；②符合手术指征，均于本院开展手术治疗；③均取得患者知情同意。排除标准：①肝肾心等重要脏器存在严重疾病者；②免疫、血液系统存在疾病者；③存在认知障碍或者精神疾病者；④生殖系统存在其他疾病者；⑤近期接触过毒物、射线或者高温者；⑥中途退出或者拒绝参与研究者。

1.2 方法及观察指标

所有患者均由相同一组医师开展手术操作，同时术前术后对MT-COI、MT-COII基因表达水平、精子计数、精子活力、精液体积以及精子DNA片段化指数（DFI）开展检测，方法如下：（1）MT-COI、MT-COII基因检测：通过RNeasy Mini Kit按照试剂盒中说明书开展操作提取总DNA，后采取DNase 1 Digesting Set将总DNA内痕量DNA去除，选择1 μg的RNA样品作为模板，经PCR法对MT-COI、MT-COII基因全片段（901bp）开展扩增处理，扩增引物是MT-COI（+）、MT-COII（+）（5’-CAAGCCAACCCC-ATGGCCTCC-3’）与MT-COI（-）、MT-COII（-）（5’-AGTATTTAGTT-GGGGCATTTCAC-3’），同时PCR的扩增条件是：95°C环境下变性4 min，后依据95°C环境下变性1 min、50°C环境下退火1 min以及72°C环境下延伸2 min反应条件进行30次循环，于72°C环境下进行10 min延伸，结束首次PCR反应。选择1 μg首次PCR扩增引物当作模板用于第2次PCR扩增。扩增引物是MT-COI（+）、MT-COII（+）（5’-CAAGCCAACCCC-ATGGCCTCC-3’）与 qhR（5’-TCCTGAGCGTCTGAGATG-3’），同时 PCR 的扩增条件是：95°C环境下变性4 min，后依据95°C环境下变性30 s、50°C环境下退火45 s、72°C环境下延伸1 min反应条件进行30次循环，于72°C环境下延伸10 min后结束第2次的PCR反应，且扩增产物于1.3%琼脂糖内的电泳条件是5 volt/cm。对琼脂糖电泳的凝胶内多态性扩增片段开展切取，经割胶纯化有关试剂盒开展纯化，经T4 DNA连接酶对pUC-T载体与巢式PCR纯化引物开展连接反应，经Cacl2转化方法转进重组质粒到TG1大肠杆菌的感受态细胞内，提取及纯化质粒DNA均依据传统方式开展。经M13通用引物开展2次序列测定，具体测序反应为上海联合基因公司进行。（2）精子及精液检测：收集患者禁欲72 h的精液样本，后于1 h内开展检测，常规精液参数采取人工分析方法，分别由3名专业操作人员独立分析，后取三者平均数值；经美国贝克曼Navios流式细胞仪对精子计数及活力进行检测；经末端转移酶引导dUTP末端标记方法对精子DFI开展检测，试剂盒为Roche公司提供，严格依据说明书执行各项操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行数据处理。正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料用频数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 术前术后MT-COI、MT-COII基因表达比较

术后，VC患者的MT-COI、MT-COII基因表达比术前有降低（P＜0.05），见表1。

表1 术前术后MT-COI、MT-COII基因表达比较（±s, μmol/mg·pro）

表1 术前术后MT-COI、MT-COII基因表达比较（±s, μmol/mg·pro）

组别 例数 MT-COI MT-COII术前 64 0.32±0.05 0.40±0.06术后 64 0.18±0.04 0.21±0.05 t 17.491 19.462 P 0.001 0.001

2.2 术前术后精子及精液参数比较

术后，VC患者的精子活力及计数比术前有升高，精子DFI比术前有降低，差异有统计学意义（P＜0.05），精液体积和术前相比，差异无统计学意义（P＞0.05），精子DFI降低（P＜0.05）。见表2。

表2 VC患者术前术后精子及精液参数对比（±s）

表2 VC患者术前术后精子及精液参数对比（±s）

组别 例数 精子活力（a=b）/%精子计数/（miL•mL-1） 精液体积/mL 精子DFI术前 64 18.85±3.62 34.52±10.20 2.75±0.56 42.65±6.10术后 64 38.75±6.40 42.86±11.38 2.84±0.52 20.42±3.46 t 21.651 4.366 0.942 25.359 P 0.001 0.001 0.348 0.001

3.讨论

VC属于引发男性不育的一类主要疾病，会给男性的生育能力带来严重影响。但当前有关VC导致生殖细胞出现功能障碍的具体机制仍未完全明确，现代医学多认为和氧化应激相关，此外，还可能和激素水平变化、睾丸组织的病理生理变化等相关，但讨论较多的为睾丸生殖细胞氧化应激学说[3]。

目前，手术属于VC患者一类主要疗法。MT-COI、MT-COII可调节线粒体的氧化呼吸产能，于中枢神经系统有关能量代谢、功能发挥中起着关键性作用，两类基因表达水平越高，代表氧化应激损伤越为严重[4]。本次研究发现，术后，VC患者的MT-COI、MT-COII基因表达比术前显著下降，说明经手术治疗能下调患者MT-COI、MT-COII基因的表达水平。据有关研究表明[5]，于VC患者精液内伴随活性氧，活性氧生成过多以及抗氧化作用下降能引发氧化应激，ROS过度可将精子细胞膜脂质过氧化启动，产生较多脂质过氧化物，使得MT-COI、MTCOII水平上升，对精子的细胞膜产生损伤，引发精子功能及形态变化，并能对精子核酸及蛋白质功能产生影响，最终引发精子DNA受损。虽常规精液参数能提供出一定价值信息，但也有一定局限性，精子质量多需结合活动度以及形态等评定[6]。有学者认为[7]，男性不育患者的正常形态精子也有高DNA断裂存在，由此可见，和常规精液参数开展比较，检测DFI有着不可取代的价值。本次研究发现，术后VC患者的精子活力及计数比术前升高，且精子DFI比术前降低，这和邓浩等[8]研究中的结果有着良好一致性，说明经手术能改善VC患者的精子参数，减轻精子DNA受损，该结果一定程度上证实了VC手术能对男性不育开展治疗的学说。

综上所述，VC患者经手术治疗能降低其MT-COI、MT-COII基因表达水平，提升其精子活力和计数，减轻其精子DNA损伤。但研究中依旧有一定不足，例如样本总量较少，未对后期怀孕率等开展随访，这些还需在日后研究中进一步完善。