不同FMR1基因的CGG重复数及血栓前状态基因多态性的女性生育结局分析

董 微，张 博（通讯作者），梁 婧，邵 超，戴君妹

（1广安门医院南区妇科 北京 102600）

（2广安门医院南区针灸科 北京 102600）

（3广安门医院南区肛肠科 北京 102600）

脆性X染色体智力缺陷1基因（FMR1）被发现其5'端非编码区的CGG重复序列在传代过程中出现异常扩增会引起脆性X综合征。该区CGG重复超过200个以上经常会随着甲基化引起FMR1基因沉默，进而使新生儿因缺乏脆性X智力减退蛋白而出现智力障碍情况[1]。携带FMR1前突变者出现卵巢功能早衰的风险性将会明显增大，但是轻度卵巢早衰也可能出现在中间区，甚至是在正常范围之内，故而FMR1基因CGG重复数可能同卵巢储备功能相关。血栓前状态会增加静脉血栓栓塞风险，导致胎盘灌注不足，进而出现不良妊娠情况[2]。但是在其基因多态性同不良妊娠方面的研究较少，仍需开展深入研究。为此，本文分析有不良孕产史的育龄期女性FMR1基因的CGG重复数以及血栓前状态基因多态性情况，现报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

将2018年9月—2020年12月本院收治的200例育龄期孕妇作为研究样本，依据其有无不良孕产史将其分成常规组（无不良孕产史，100例）以及实验组（有不良孕产史，100例）。常规组与实验组孕妇中，平均年龄分别为（30.68±2.11）岁、（30.73±2.15）岁。两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

（1）提取全血基因组DNA，采集孕妇2 mL上臂静脉血，使用磁珠法全血基因组提取试剂盒（NanoMagBio NMG0121），完全按照试剂盒说明书对全血样本进行基因组DNA提取。仪器：NanoMagBio S-96自动核酸提取仪。（2）PCR扩增，PCR体系有FMR1引物、高GC聚合酶溶液以及高GC扩增缓冲液。除高GC聚合酶试剂外全部试剂实施解冻和涡旋，依据说明书添加相应剂量后实施离心以及涡旋混匀。在96孔PCR检测板中添加20 ng/ul DNA模板1 μL，将其充分混合后密封，重复进行涡旋以及离心。之后利用ABI-9700型定量PCR仪（采购自美国ABI）实施扩增。将384PCR板放置在384pcr仪加热模块上，核对程序信息，程序如下：94 ℃2 min，之后以 94 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 形式开展45次循环，随后72 ℃ 5 min，12 ℃长期。用虾碱性磷酸酶（SAP）将Pre-PCR反应后体系中剩余的dNTPs去磷酸化，使其转化为dNDPs，防止dNTPs影响下一步的延伸反应。在ddNTPs存在的条件下，通过多重PCR反应使引物延伸一个碱基，从而得到目的基因片段中的待测位点——单碱基延伸反应。核对程序信息，程序如下：94 ℃ 30 s，之后以 94 ℃ 5 s、52 ℃ 5 s、80 ℃ 5 s 形式开展45次循环，其中以52 ℃ 5 s、80 ℃ 5 s形式开展5次循环，随后72 ℃ 3 min、12 ℃长期。质谱检测实验中的阳离子交换树脂纯化实验步骤，通过阳离子交换树脂纯化去除PCR产物中的阳离子等。（3）血栓前状态基因检测，采集孕妇外周静脉血2 mL，将其置于乙二胺四乙酸试管内。通过核酸分离纯化和加样系统（采购自罗氏公司），选择200 μL全血中基因组DNA开展纯化，并选择100ngDNA，对其中凝血因子Ⅱ基因、凝血因子Ⅴ基因、纤溶酶原激活剂抑制物-1基因5 G/4 G、亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因677位点基因型、MTHFR基因1298位点基因型以及甲硫氨酸合成还原酶（MTRR）突变位点实施探究。

1.3 观察指标

（1）分析CGG重复序列分布情况。（2）对比两组孕妇前突变以及灰区分布情况。（3）分析两组孕妇前突变核型的CGG重复数目。（4）分析不同基因位点同风险等级之间关联性。（5）对比不同风险等级孕妇生育结局。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理。正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料用频数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 CGG重复序列分布情况

在200例孕妇中，不同CGG重复数目检测结果为35种，其中CGG重复数目变异区间是20～200。CGG重复数目排列前三位分别是31（65例，32.50%）、28（55例，27.50%）、35（30例，15.00%）。

2.2 两组孕妇前突变以及灰区分布情况比较

实验组灰区以及前突变占比均高于常规组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组孕妇前突变以及灰区分布比较[n（%）]

2.3 实验组孕妇血栓前状态发生风险情况

在100例实验组孕妇中，12例（12.00%）属于低风险、59例（59.00%）属于中风险、29例（29.00%）属于高风险。

2.4 不同基因位点同风险等级的相关性

伴随血栓前状态发生风险程度的提升，PAI-1基因675位点基因型5 G/5 G以及MTHFR基因677位点基因型TT占比逐渐升高，见表2。

表2 不同基因位点同风险等级之间关联性（例）

2.5 不同风险等级孕妇生育结局情况比较

低风险孕妇中，1例（8.33%）流产；中风险孕妇中，5例（8.47%）流产；高风险孕妇中，8例（27.59%）流产。三组流产率差异有统计学意义（χ2= 6.262，P＜0.05）。

3.讨论

当卵巢储备功能下降时，则说明卵巢内存留的可募集卵泡数量降低，使得卵母细胞质量下降，进而出现不孕或生育功能下降等情况。对于存在无诱因反复流产的患者而言，相较于正常人，其卵巢储备功能有明显下降，并且其出现胚泡非整倍体概率增大。伴随产前诊断和基因检测技术在临床的应用，发现存在不良孕产史的女性，其胎儿染色体异常和基因异常存在明显关联性[3]。

卵巢储备功能降低同FMR1基因存在相关性，并且CGG序列重复数在判断卵巢功能受损程度方法具有重要作用。在本次研究中，常规组灰区以及前突变占比均低于实验组（P＜0.05）。提示存在不良孕产史的女性中，实施FMR1基因筛查，对预测其妊娠结局具有重要作用。当FMR1基因发生前突变时，会加速卵泡闭锁，导致卵泡数量下降，进而出现卵巢功能减退情况。妊娠早期若出现血栓前状态，则会表现为自然流产；而妊娠晚期出现血栓前状态，则会引起胎盘早剥、胎儿宫内发育迟缓和死产等情况[4]。本次研究中发现，伴随血栓前状态发生风险程度的提升，PAI-1基因675位点基因型5 G/5 G以及MTHFR基因677位点基因型TT占比逐渐升高。高风险孕妇流产率均高于低风险、中风险。MTHFR是调节四氢叶酸以及半胱氨酸代谢的重要酶，PAI-1活性上升会导致纤维蛋白溶解，使得血液呈高凝状态，进而诱发血栓前状态[5]。因此，当上述两基因位点基因型占比升高时，孕妇发生血栓前状态的风险性则显著升高，出现不良妊娠结局的概率增大。

综上所述，FMR1基因前突变的风险性升高常见于有不良孕产史的女性，而血栓前状态基因多态性会导致血栓出现，进而引起流产等不良妊娠结局。