微环境下Wnt/β-catenin通路参与牙周膜干细胞骨向分化机制的研究进展

沈振国，赵荣权，欧琳琳，周 柠 综述 邢 田 审校

牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)以其多向分化的能力以及易于获取的组织来源优势，成为非常理想的组织工程种子细胞，在牙周再生领域中得到广泛的应用。然而，PDLSCs成骨分化能力受到多种因素的调控，其分化机制也是近年来的研究热点，Wnt/β-catenin作为调节细胞生长和分化的重要信号途径，在PDLSCs的分化中发挥重要的作用。

1 牙周膜干细胞的生物学特性

Seo et al于2004年成功从离体牙牙周组织中分离培养出PDLSCs，发现其具有较强的克隆形成能力，及成牙骨质、成神经、成脂等多项分化能力，且高表达间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)表面标志物STRO-1和CD 146/MUC 18，可成为最具牙周组织修复潜力的干细胞之一。自Lindroos et al揭示PDLSCs成骨分化具有临床应用价值后，围绕这方面的研究取得较大进展。体外实验采用含地塞米松、β-磷酸甘油和抗坏血酸的成骨诱导液培养PDLSCs，发现成骨相关基因表达升高，如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、特异性Runt相关性转录因子(Runt-related transcription factor，Runx)2、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)2、胶原蛋白(collagen，Col)Ⅰ、骨钙素(osteocalcin，OCN)，细胞体外长期培养能够形成钙化结节。

PDLSCs迁移和增殖对修复缺损具有重要作用，而其迁移和增殖受细胞周围环境、代谢产物、神经递质、细胞因子等的影响。基质细胞衍生因子(stromal cell derived factor，SDF)1、甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)、和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)2等细胞因子能够促进PDLSCs的增殖和迁移。

2 Wnt/β-catenin通路

1982年Nusser et al在小鼠乳腺癌中发现了Integration-1(INT-1)基因。之后的研究表明，果蝇中的的无翅基因与INT-1基因功能类似，属于同源基因，因此将二者并称为Wnt基因，此基因调控的信号传导系统为Wnt通路。此通路对细胞的生长、分化以及募集等多种生物学过程发挥重要作用，且与肿瘤、炎性疾病和心血管疾病等密切相关。

Wnt通路由4部分组成：①细胞外的配体蛋白Wnt蛋白，由Wnt家族基因转录表达而来；②细胞膜上的卷曲蛋白受体(frizzled，Fzd)及低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP)5/6；③细胞浆中的信号转导部分；④细胞核内的转录调控部分。

Wnt/β-catenin通路，即经典Wnt通路：胞膜外配体Wnts蛋白与受体结合后，开启通路的传导并活化胞内的蓬乱蛋白(dishevelled，Dsh/Dvl)从而降低由腺瘤性结肠息肉病蛋白(adenomatous polyosis coli，APC)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、Axin、β-连环蛋白(β-catenin)等形成的降解复合体中关键成分GSK-3β的活性，进而阻止β-catenin降解，使β-catenin积聚并转移入核与胞核内的转录因子T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEFs)结合，激活下游靶基因，引发生物学效应。

3 局部微环境调控Wnt通路影响PDLSCs成骨分化

3.1 炎症微环境

Wnt/β-catenin通路在炎症微环境中对PDLSCs的成骨起着重要的作用。慢性牙周炎患者炎症牙龈和龈沟液中高表达白细胞介素(interleukin，IL)-33，体外实验中牙龈卟啉单胞菌可活化牙龈上皮细胞高表达IL-33。IL-33可促进增殖和克隆形成率，但是抑制ALP的活性和矿化结节的产生，给予PNU(β-catenin抑制剂)的处理，可以恢复这种抑制效应，表明IL-33通过Wnt/β-catenin通路调控PDLSCs的成骨分化潜力。

低浓度(≤1 μg/ml)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是否抑制PDLSCs成骨分化尚存争议。Xing et al使用低浓度(0.5μg/ml)大肠杆菌LPS活化PDLSCs，发现Wnt/β-catenin通路蛋白Cyclin和激活转录共刺激因子(transcriptional activator with a PDZ motif，TAZ)表达增高，成骨关键基因Runx 2、ALP、Col-Ⅰ表达增高，茜素红染色显示钙化结节增多。降低TAZ同时可以降低LPS诱导的成骨增强作用。此外，阻断Wnt/β-catenin通路可以抑制LPS引起的成骨分化。然而，文献报道，高浓度LPS(≥10μg/ml)可显著抑制PDLSCs增殖和成骨分化，同时促进炎性因子表达，加重牙周组织的损伤。可见，LPS通过Wnt/β-catenin通路调控干细胞成骨分化作用依赖LPS浓度。

Peng et al体外分离培养患者的PDLSCs，发现源自牙周炎患者炎症组织的细胞较正常受试者，其成骨分化能力明显降低。长链非编码RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)可能参与Wnt信号通路的调控来调节干细胞成骨分化能力。在PDLSCs成骨分化过程中，ALP、Runx 2和成骨相关转录因子抗体(osterix，OSX)的表达增加，而lncRNA-ANCR的表达减少。lncRNA-ANCR可能通过抑制microRNA(miR)-758，进一步激活Notch2/Wnt/β-catenin通路，从而抑制PDLSCs成骨分化。

Wang et al分离培养牙周炎患者炎症局部PDLSCs，高通量测序发现，与正常组相比，lncRNA-POIR显著降低。lncRNA-POIR作为显著的促进成骨的基因，可能作为miR-182的竞争性内源性RNA，调控其靶基因FoxO1表达，继而，FoxO1通过与TCF-4竞争β-catenin，抑制经典Wnt通路，增加其成骨分化。然而，Wnt通路参与调控成骨可能与其他信号通路存在串联关系，如NF-кB。炎症通过NF-кB通路增加miR-182的表达，同时miR-182在炎症微环境中的过表达导致了lncRNA-POIR/miR-182调节网络的失衡。

3.2 高糖微环境

体外试验中，当暴露于高糖环境时，PDLSCs产生细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)，成骨能力降低。清除ROS可激活PI3K/Akt进而促使β-catenin入核结合TCF/LEF，阻断高糖介导的PDLSCs成骨抑制。这表明高糖环境使PDLSCs内产生氧化损伤，通过抑制PI3K/Akt/Wnt/β-catenin通路抑制其成骨分化。

糖尿病大鼠牙周膜组织DNA甲基化水平升高，牙槽骨骨量和密度降低。体外实验，高糖处理PDLSCs可降低β-catenin、p-GSK-3β和LEF 1表达。DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-2-脱氧胞苷(5-Aza-DC)，可降低PDLSCs DNA甲基化水平，并挽救了PDLSCs在高糖环境下降低的成骨分化。然而，采用Wnt通路的拮抗剂Dickkopf相关蛋白(Dickkopf-related protein，DKK)-1，可以阻断5-Aza-DC在高糖中对细胞成骨分化的保护作用。这一研究首次提出，在高糖环境下，抑制DNA甲基化可通过Wnt信号通路促进PDLSCs的成骨分化。以上研究表明，糖尿病导致的PDLSCs 成骨分化能力降低可能是通过DNA甲基化抑制Wnt/β-catenin通路造成的。

然而，体外将PDLSCs进行成骨诱导，用晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)处理细胞，细胞成骨能力降低，表现出ALP活性降低，矿化结节形成减少，成骨特异性基因Runx 2、OSX、ALP、OPN、Col-Ⅰ和OCN表达下调。经典Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV-939部分挽救了AGE诱导的PDLSCs成骨潜能的抑制。可见AGEs激活了经典Wnt/β-catenin通路，促进了β-catenin的核转位，从而减弱了PDLSCs的成骨分化能力。

3.3 生物应力

用循环液压模拟生理性的咀嚼，压力刺激下乳牙PDLSCs成骨能力受抑制。在循环液压下，乳牙PDLSCs中α7烟碱型乙酰胆碱受体(alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors，α7 nachr)被激活，GSK-3β去磷酸化，激活Wnt/β-catenin通路，核因子кB受体活化因子配体(receptor activator of NK-κB ligand，RANKL)上调、Runx 2、ALP和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)的降低，PDLSCs表现出诱导破骨细胞分化的能力。抑制α7 nachr或Wnt/β-catenin通路可逆转成骨抑制。

然而，PDLSCs在液压压力模拟的正畸力的作用下成骨分化，且短期作用(1 h)较长期作用(12 h)的成骨效应较强。在力的作用下，PDLSCs中的GSK-3β磷酸化，活化β-catenin入核，激活Wnt/β-catenin通路，促进PDLSCs成骨分化。这可能与PDLSCs不同年龄来源(乳牙和恒牙)相关。可见在PDLSCs分化的不同阶段，生物应力作用下的Wnt/β-catenin通路起到正向或负向的调控作用，以满足机体发育的不同阶段的需求。

3.4 药物

阿奇霉素(azithromycin，AZM)结合非手术牙周疗法可缓解临床症状，同时抑制破骨细胞分化和骨吸收。体外试验中，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α活化PDLSCs致使ALP活性降低，钙化结节减少。AZM的加入使得降低PDLSCs成骨分化能力得到回升。同时β-catenin、磷酸化p65和磷酸化IκB-α蛋白表达下降。这表明，AZM通过同时抑制Wnt/β-catenin和NF-κB通路，促进PDLSCs在炎症微环境中的成骨分化。

积雪草苷(asiaticoside，AC)可促进伤口愈合，具有抗炎、抗氧化和抗溃疡的活性。体外实验中，AC可促进PDLSCs成骨分化，能够显著上调PDLSCs中Wnt 3a基因的表达，并呈剂量依赖性(最适浓度100 μmol/L)，同时抑制Wnt的负调节因子Axin 2，激活Wnt/β-catenin通路，进而诱导OSX和牙本质基质蛋白(dentin matrix protein，DMP)1表达，促进PDLSCs成骨分化。

作为胰高血糖素样肽-1类似物，肠促胰岛素类似物(exendin-4，Ex-4)在细胞和分子水平上都具有快速的抗炎作用，对MSCs成骨分化有积极的影响。Ex-4同样增强PDLSCs的成骨分化能力，Ex-4处理使细胞核与细胞浆的β-catenin蛋白表达均上调，GSK-3β磷酸化增加，Wnt/β-catenin通路激活，同时促进IκBα磷酸化来抑制NF-κB通路的活化。Ex-4亦可以通过相同机制减轻高浓度LPS(10μg/ml)对PDLSCs的成骨分化抑制作用。

吸烟已被公认为牙周炎的独立危险因素之一，烟草的有效成分尼古丁可以抑制胶原合成、破坏上皮结构，引起牙周局部组织损伤。尼古丁对PDLSCs的成骨分化的抑制作用具有剂量依赖性。尼古丁处理可激活α7 nachr从而激活Wnt/β-catenin通路，抑制PDLSCs成骨。分别抑制α7 nachr和Wnt/β-catenin通路可挽回受抑制的PDLSCs成骨分化。

3.5 生物支架

近年来随着种植技术临床应用增多，研究者多聚焦于传统材料的改良和新型材料的研发。体外实验中，将PDLSCs培养于聚苯乙烯(TCPS)上，和四种没有骨诱导因子的钛盘[光滑的抛光处理(PT)、亲水性抛光处理(pmodPT)、粗糙喷砂-大颗粒-酸蚀(sandblasted，large-grit，acid-etched，SLA)和亲水性(mod)SLA]，然后检测成骨活性。与TCPS和其他钛表面相比较，培养在SLA上的细胞出现较高的成骨活性。SLA和modSLA上培养的细胞高表达Wnt3a和β-catenin，但在PT和pmodPT上细胞却高表达钙依赖性Wnt信号分子Wnt5a、钙调素；此外，不同的表面修饰也会改变细胞整合素α2/β1、sonic hedgehog和Notch信号分子的表达。总之，表面粗糙度和亲水性可以影响不同的Wnt通路和信号分子参与调控PDLSCs的成骨分化。

Mao et al以α-磷酸三钙颗粒为前驱体，在水溶液中通过水热反应制备了具有微纳米杂化表面的羟基磷灰石(HA)生物陶瓷(mnHA)，与具有平坦致密表面的HA生物陶瓷相比，mnHA生物陶瓷能够促进细胞黏附、增殖、ALP活性以及成骨/成牙骨质基因的表达。此外，mnHA生物陶瓷还能引起经典Wnt信号通路中LRP5和β-catenin的表达上调。DKK-1可抑制ALP活性和ALP、OCN、CAP、CEMP和Runx 2基因的表达。可见，能够成为牙周组织再生的材料mnHA通过Wnt通路促进成骨/成牙骨质。