类器官模型在乳腺癌中的研究进展*

李 圆， 何伟丽， 王宁霞， 曲少华

（暨南大学附属第一医院乳腺外科，广东广州 510630）

乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，2020 年全球乳腺癌新发病例高达226 万例，超过了肺癌成为全球第一大肿瘤，严重威胁着女性健康［1］。乳腺癌是高度异质性的疾病，第2 代测序技术证实，在93 个编码蛋白质的乳腺癌基因中携带可能的驱动突变［2］。因此，现行的基于乳腺癌临床病理特征以及雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）及人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表达制定综合方案，并非适用于所有的乳腺癌患者。传统的二维细胞培养和人源性肿瘤异种移植模型为乳腺癌的研究探索提供了大量的材料，但由于实验技术缺陷、培养周期长等因素难以满足深入的研究要求。因此，建立一种能够准确模拟人体肿瘤特征的实验模型成为迫切需要。近年来，通过优化各种培养条件建立的乳腺癌类器官模型，由于其取材方便、培养周期短和遗传稳定等特点，能够最大程度的还原乳腺癌细胞在体内的组织和分子特性，重现部分乳腺功能［3］，有望在乳腺癌发病机制研究、个体化治疗、新药开发等领域发挥重要作用。

1 类器官技术

1.1 类器官的概念 为了探索能够模拟体内环境的三维培养模型，Clevers 等［4］通过对小肠干细胞的分离培养，成功建立了肠道类器官培养系统。该研究显示，单个干细胞能以自组织形式构建肠道隐窝绒毛结构，干细胞周围的微环境则形成干细胞龛（stem cell niche）。干细胞龛是肿瘤微环境的组成部分，其主要包含成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞、细胞因子、生长因子、细胞外基质等。在干细胞龛中，干细胞可通过细胞-细胞直接或间接接触形式进行自我更新、调控自身增殖和分化［5］。类器官即是在特定培养条件下对干细胞龛的构建。正常组织或肿瘤组织来源的干细胞在受到体外提供的细胞因子或生长因子的刺激下，重建干细胞龛，形成具有自组织能力的三维结构，即类器官。类器官既能重现来源组织的结构和功能［6］，又能模拟体内组织的原始生物学特性，成为二维细胞培养、人源性肿瘤异种移植模型和器官组织切片模型以外的第4 种临床前模型，兼具前三者优点，在肿瘤研究中具有广泛的应用价值［7］。目前，类器官技术在生物医学领域，包括干细胞模型、肿瘤研究模型、个体化治疗模型和新药开发临床前模型等多个研究领域已取得研究进展。

1.2 乳腺癌类器官培养的进展 DeRose 等［8］于2013年将乳腺癌组织样本通过机械破坏和酶消化相结合的方法，制定出首个乳腺癌患者来源的类器官基础培养方案。实验结果表明，不同来源的肿瘤组织所需的消化时间各不相同，患者来源的肿瘤组织消化至少过夜，小鼠移植来源的肿瘤组织所需的消化时间则可适当缩短。为了提高类器官培养成功率，研究人员继续在培养条件上进行优化探索。Zubeldia-Plazaola 等［9］观察到，在酶浓度较低的情况下延长消化时间，培养形成类器官的成功率更高。Samanth 等［10］在胶质母细胞瘤的干细胞培养基中添加特异性ROCK 蛋白抑制剂Y-27632或法舒地尔，提高了干细胞的体外存活和增殖能力，降低了类器官在接种到新的培养基后失巢凋亡的发生率，证实ROCK 蛋白抑制剂可以优化肿瘤干细胞培养基。随后，Sachs 等［11］对乳腺癌类器官基础培养方案再次进行了优化。研究人员将患者来源的乳腺癌细胞接种在细胞外基质Matrigel 上，检测添加不同因子对构建类器官的影响。结果显示，添加丝裂原神经调节蛋白1（neuregulin 1，Nrg1）能有效促进乳腺癌类器官的形成与传代，证实Nrg1 可能是乳腺癌类器官培养基的一个重要补充因子；添加浓度高于5 ng/mL 的表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）能促乳腺癌上皮细胞增殖，但也会使乳腺癌类器官逐渐沉降于Matrigel 中导致其三维结构消失。Wnt-3A 作为一种包含328 个氨基酸残基的单链蛋白质，可在维持干细胞龛上起关键作用，但添加Wnt-3A 并未对类器官的培养条件起到改善作用；MAPK 抑制剂SB202190 可促进多能干细胞稳定性，但其添加浓度高于1 mmol/L 也会降低类器官的形成效率。至此，Sachs 等［11］建立了乳腺癌类器官生物库，含有超过100个乳腺原位癌和转移癌的类器官系，为开展乳腺癌类器官研究提供了依据。

2 乳腺癌研究模型

2.1 二维细胞系模型 传统的二维细胞培养是指在体外人工模拟体内环境，使单个细胞或细胞群在二维平面生存、增殖、传代等的细胞培养技术。目前，乳腺癌研究领域已有超过50 种不同的二维细胞系，其构建简单、经济并可进行高通量药物筛选，被广泛应用于乳腺癌的基础研究和药物敏感性等研究［12］。但二维细胞系分化来源于单个细胞，缺乏肿瘤细胞的异质性以及肿瘤细胞与肿瘤微环境的相互作用［13］，存在生物稳定性差、可能出现优势细胞克隆而致潜在的基因突变等缺点，无法良好地重现肿瘤组织的多样性［14］，由此也引发了二维细胞系是否能够精准代表不同类型乳腺癌的思考。

2.2 人源性肿瘤异种移植模型 人源性肿瘤异种移植是将肿瘤细胞或组织通过原位移植或皮下移植到免疫缺陷动物（通常为免疫缺陷小鼠）体内，进而实现肿瘤细胞的生长增殖［15］。该体内模型可实现肿瘤细胞或组织的血管生成，相对接近真实的人体肿瘤内环境，可对患者的特异性疗效反应进行模拟。此外，该模型还能在一定程度上重现患者体内的炎症反应，反映肿瘤异质性和生物学稳定性。相比二维细胞系，人源性肿瘤异种移植模型虽在模拟肿瘤微环境方面有独特优势，但由于其培养周期长、费用高、动物应激反应等特点，其定量数据获取困难，难以大规模应用于临床试验。此外，肿瘤发生在人体内和动物体内存在的组织学和基因组学异质性也是该模型不适用于高通量药物筛选的原因之一［16］。

2.3 器官组织切片模型 器官组织切片模型在许多方面平衡了二维细胞系模型和人源性异种移植模型的优点和缺陷。不同厚度的器官组织切片，可以在适当条件下保存数周至数月。与人源性肿瘤异种移植模型相似，器官组织切片模型能在短时期内维持基本的组织病理学结构，可用于精确的药物筛选［17］，同时也可实现更加个体化的患者疗效评估。相比二维细胞系模型，器官组织切片模型难以长期保存［18］，无法反映肿瘤干细胞的潜能，因此，仅能体现部分肿瘤组织特性［19］。

2.4 类器官模型 类器官技术的发展，可在一定程度上弥补上述传统培养技术的缺陷。目前，类器官培养技术已成功应用于胃癌［20］、结直肠癌［21］、肺癌［22］、前列腺癌［23］等肿瘤研究。培养类器官模型所需的基质胶大多数来源于小鼠肉瘤，这种在室温条件下可聚合的具有生物学活性的三维基质，主要成分为层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白（nidogen）和硫酸肝素糖蛋白，以及生长因子、基质金属蛋白酶等，可用于模拟体内细胞基底膜的结构组成、物理特性和生物功能，有利于细胞的体外分化及培养。另有Kim 等［24］观察到，EGF、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、转铁蛋白、地塞米松、WNT 激活剂等在类器官模型培养中发挥重要作用。与其他模型相比，类器官模型标本可以来源于手术或穿刺活检，灵活便捷，还能在培养过程中维持基因组稳定性，重现原始肿瘤的异质性［25］，可用于研究细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用特点。此外，类器官培养周期较短，1～2 周即可进行传代［19］，时效性强，可操作性高，能够实现二维细胞系模型和人源性肿瘤异种移植模型无法进行的高通量药物筛选，同时也降低了动物实验所涉及到的伦理风险，在肿瘤研究领域具有广泛应用前景［26］。

3 乳腺癌类器官在转化医学中的应用

3.1 乳腺癌类器官生物库 基于基因组学、病理学和组织学特征上的差异，乳腺癌被划分为多个不同的亚型。Sachs 等［11］对乳腺癌组织和乳腺癌类器官的HE染色切片进行组织学分析，结果显示大部分乳腺癌类器官的形态与原始肿瘤的组织病理学特征、激素受体以及HER2 受体的表达水平相匹配；对乳腺癌类器官的全基因组DNA 测序结果进行拷贝数变异和体细胞突变等分析，证实乳腺癌类器官能囊括乳腺癌的基因组学多样性，包括拷贝数变异、癌基因突变以及突变特点等；结合超过1 100 个来自TCGA 的乳腺癌数据库，以及基于超过25 000个基因所构建的相关热图，对22 个乳腺癌类器官进行RNA测序分析，证实乳腺癌类器官能涵盖主要的乳腺癌亚型且在数据库中随机分布。因此，乳腺癌类器官在一定程度上能反映人体乳腺癌的组织学和遗传学异质性，在培养过程中能够维持基因组稳定性，适用于高通量药物筛选，丰富了新药开发的实验材料来源。对于研究人员而言，乳腺癌类器官生物库的建立，可以减少实验标本取材的繁琐流程，降低伦理风险，为乳腺癌研究提供可靠模型。对于患者而言，乳腺癌类器官生物库若能取代新药研发的前期临床试验，将为乳腺癌患者实现个体化治疗带来希望。

3.2 模拟乳腺癌的发生与进展 类器官模型最大的潜能之一是探索疾病发生发展的机制研究。为了模拟乳腺癌的发生，Dekkers 等［27］将正常乳腺上皮组织培养形成乳腺类器官，随后借助CRISPR-Cas9 基因编辑技术靶向敲除了4 个与乳腺癌相关的抑癌基因p53、PTEN、RB1和NF1，使乳腺类器官转变为乳腺癌类器官并获得在体外长期生存的能力。将通过该方法构建的乳腺癌类器官移植到小鼠中，评估单基因突变的致瘤能力，结果显示在移植瘤中，有1/6出现了p53、PTEN和RB1突变，有1/2 出现了p53、PTEN、RB1和NF1突变，且均对内分泌治疗和化疗敏感，由此揭示了乳腺癌发生的分子机制。同样，Drost等［28］利用CRISPR-Cas9技术对正常肠道类器官中的APC、p53、KRAS和SMAD4等与结直肠癌发生相关的基因进行靶向修饰，使其转变为结直肠癌类器官，并构建异植瘤模型，观察到肿瘤可以表现出浸润性生长的特征。类器官模型结合CRISPR-Cas9 基因编辑技术，不仅可以模拟肿瘤的发生发展，揭示肿瘤的形成机制，未来或还可以通过CRISPR-Cas9 基因编辑技术引入或删除基因片段，达到抑制甚至逆转肿瘤细胞增殖的目的，实现肿瘤的基因治疗［29］。

3.3 抗肿瘤药物筛选 尽管二维细胞系模型已经广泛应用于药物筛查试验，但由于其不足以反映原始肿瘤特征，以致临床试验中新药的研发困难。越来越多的研究显示，类器官模型在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、食管癌、肝癌和子宫内膜癌等肿瘤疾病中具有良好的应用前景［14］。其中，在乳腺癌类器官生物库中进行的小规模药物筛选试验已取得可喜成果。Sachs等［11］通过检测HER2过表达的乳腺癌类器官对抗HER2 靶向药物（如阿法替尼、吉非替尼等）的敏感性，证实类器官对抗HER2 靶向药物敏感。同样，BRCA1突变的乳腺癌类器官对PARP 抑制剂（如奥拉帕尼、尼拉帕尼等）治疗敏感。该研究在一定程度上证实乳腺癌类器官可用于乳腺癌的药物敏感性的检测。Vlachogiannis 等［26］针对转移性结直肠癌类器官进行了临床常用药物和临床试验药物的敏感性检测，在评估患者的疗效反应后报道了88%的阳性预测值和100%的阴性预测值，也证实了类器官在抗肿瘤药物筛选方面的应用价值。此外，将类器官模型的药敏检测结果和基因检测结果结合分析，还能获得针对患者个体有效的药物信息，从而指导临床用药，实现个体化治疗；如果培养患者的正常组织类器官并给予抗肿瘤药物处理，还能检测该药物对患者正常组织的毒性，从而权衡药物疗效，制定最佳治疗方案。

3.4 药物疗效和毒性评估 乳腺癌类器官具有模拟肿瘤微环境的优势，可用于药物疗效和毒性评估。在药物疗效方面，Walsh 等［30］通过光学代谢成像（optical metabolic imaging，OMI）量化NADH 和FAD 在6个不同的原始乳腺癌样本中的荧光强度和半衰期，评估乳腺癌类器官对于抗肿瘤药物如紫杉醇、抗HER2 抗体曲妥珠单抗、IP3 途径抑制剂XL147 的单药及其联合用药的药物敏感性，在临床中证实了曲妥珠单抗的使用不会改变OMI 指数，也不会改变紫杉醇和他莫昔芬的疗效反应。在药物毒性评估方面，研究人员利用细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用原理以及生物化学和力学特性，结合微流控技术构建了乳腺癌类器官的微芯片培养方案。该研究表明，虽然三维细胞培养的生长速度较二维培养缓慢，但应用微芯片培养的方法检测不同的抗癌药物如丝裂霉素和5-氟尿嘧啶的细胞毒性结果与传统的MTT法同样有效。亦有用恶性肿瘤患者外周血和腹水提纯的肿瘤细胞成功建立的类器官的报道［31］，为晚期乳腺癌患者化疗敏感药物筛选及药物疗效评估提供了可能。

3.5 过继细胞免疫治疗（adoptive cell immunotherapy，ACT） 随着单一药物靶向治疗耐药问题的出现，利用患者自身的免疫系统，结合类器官与淋巴细胞体外共培养的ACT被认为是降低单药耐药风险的有效策略［32］。ACT 是指通过提供良好的微环境，调控抗肿瘤淋巴细胞的体外扩增，保证其重新输注到患者体内后持续增殖并发挥抗癌效应的一种个体化癌症疗法［33］。目前，已有利用类器官模型和患者自身的免疫系统进行肿瘤治疗的相关研究报道。Zumwalde 等［34］报道，氨基双膦酸盐（aminobisphosphonate）能够促进来源于正常乳腺组织类器官的γδT淋巴细胞扩增，而γδT淋巴细胞能够分泌抗肿瘤细胞因子IFNγ，从而有效地杀死三阴性乳腺癌细胞。Nozaki 等［35］检测到，在培养基中加入IL-2、IL-7 和IL-15 后，小鼠肠道类器官的上皮内淋巴细胞可在体外存活扩增并维持其功能超过数周，由此优化了对类器官与淋巴细胞的共培养条件。近年来，乳腺癌免疫治疗取得巨大进步，特别是给晚期三阴性乳腺癌患者带来生存获益。但目前乳腺癌免疫治疗尚缺乏准确预测疗效和预后的标记物。将类器官技术应用于肿瘤的免疫治疗，不仅可以检测免疫抑制剂（如PD-1和PD-L1抗体）疗效，还能预测免疫治疗的反应，为实现个体化免疫治疗带来希望［36］。此外，胸腺类器官平台的建立还可能为肿瘤特异性T 细胞的有效扩增研究出一个更加符合生理的体外环境［37］，类器官模型在乳腺癌免疫治疗中具有广泛的应用前景。

4 限制与展望

尽管类器官在乳腺癌的肿瘤建模、发生发展机制、药物筛选等基础研究方面都能发挥重要作用，但其在乳腺癌的临床转化方面仍存在多方面的限制。首先，与传统肿瘤研究模型相比，乳腺癌类器官的培养条件尚不成熟，建立乳腺癌类器官的成功率远低于80%，其培养方案仍有待进一步优化［38］；其次是可重复性欠佳，即使在相同的培养条件下，同一来源的组织也并不能培养出表征完全相同的乳腺癌类器官。解决以上难题，是乳腺癌类器官模型临床转化应用的关键，仍需深入研究［39］。此外，乳腺癌类器官缺乏血管化的过程，而新生血管、基质以及免疫细胞等构成的肿瘤微环境对肿瘤的治疗效果至关重要［19］，因此限制了乳腺癌类器官的临床转化应用。目前，建立免疫细胞参与的类器官共培养体系已成趋势，该体系模拟肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用，模拟更加真实的人体内肿瘤生长环境，使乳腺癌类器官成为更加精准的体外肿瘤研究模型。

综上所述，利用乳腺癌患者的肿瘤组织提取肿瘤干细胞培养成乳腺癌类器官，应用于肿瘤建模、肿瘤发生发展机制、药物筛选方面等的基础研究与临床转化研究，是乳腺癌类器官作为临床前研究模型的独特优势。建立成熟的乳腺癌类器官平台，使实现乳腺癌患者的个体化治疗成为可能，将是未来类器官技术的研究热点。