自噬流在细颗粒物诱导的气道炎症中的变化及成纤维细胞生长因子10调控自噬流的抗炎效应*

董 年， 王 强， 施强强， 刘玲静， 陈俊杰

（温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，浙江省介入肺脏病学重点实验室，浙江温州 325000）

日益严重的空气污染是我国目前呼吸道疾病发病率居高不下的重要原因，细颗粒物（particulate matter，PM）是空气污染物中的重要成分，流行病学调查发现生活中PM 暴露强度与呼吸道炎症效应密切相关［1］。目前在PM 暴露相关呼吸道炎症效应方面没有特别的干预措施，深入研究其中的病理生理过程，在呼吸道疾病的防治方面具有一定的公共卫生意义。我们经气道滴注PM的方式构建PM短时暴露动物模型研究呼吸道炎症效应，发现PM 短时暴露导致以气道炎症为主的病理改变［2］，伴随肺组织成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，FGF10）的表达升高［3］。FGF10是一个经典的旁分泌FGF，经间充质-上皮交互作用的方式介导间充质细胞与上皮信号之间的信号传导［4］，在病理状态下的支气管-肺上皮损伤修复中发挥重要调控作用［5］。目前围绕FGF10 在PM 气道炎症方面的研究甚少，间充质来源的FGF10 在病理状态下参与支气管-肺上皮修复的分子机制仍待阐明。自噬是细胞在应激条件下的一种防御调控机制，参与肺脏的损伤修复病理生理过程［6］。Chen 等［7］报道PM 可以诱导气道上皮细胞的自噬，参与气道上皮细胞的炎症反应，自噬抑制发挥抗炎作用［8］。至于自噬与FGF10 之间的联系，Tan等［9］发现在肾脏缺血再灌注条件下FGF10 可以调控自噬相关蛋白LC3 抑制肾小管上皮细胞自噬水平，在肾脏缺血再灌注下发挥保护作用。结合以上文献研究报道，本研究拟在构建PM 短时暴露动物模型和细胞模型的基础上，探讨自噬流在PM 诱导气道炎症中的变化以及FGF10是否调控自噬流发挥抗炎效应和潜在的分子机制。

2.2.4 ATCI溶液 精密称取适量ATCI粉末，用PBS缓冲液（pH 8.0）配制成0.075 mol/L的溶液。

材 料 和 方 法

1 材料

6～8 周龄SPF 级雄性C57BL/6 小鼠（20～22 g）购自北京维通利华实验动物技术公司，许可证号为SCXK（京）2016-0011。人正常气道上皮细胞BEAS-2B购自上海中科院细胞库。PM购自NIST，具体类型SRM 1649b，主要成分包括多环芳烃类、硝基多环芳烃、苯醚、多氯联苯同系类、含氯有机农药、八氯莰烯同系物、多氯二苯并对二英、二苯并呋喃同系物和其他无机颗粒物质；RPMI-1640培养液和胎牛血清购自Gibco；动物实验重组FGF10 购自温州医科大学药学院；细胞实验重组FGF10 购自Peproptech；抗自噬相关分子（LC3 和p62）的抗体和抗NF-κB 通路分子（pp65、p65、p-IκBα 和IκBα）的抗体购自Cell Signaling Technology；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）购自Sigma；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、预染蛋白Marker和ECL发光液购自Thermo。

2 方法

2.1 动物模型的建立 选取40 只6～8 周龄SPF 级雄性C57BL/6 小鼠（20～22 g），均以10 mL/kg 的剂量腹腔注射水合氯醛麻醉，随机分为4 组（n=10）：（1）空白对照（vehicle）组：25 μL PBS 气道滴注，连续气道滴注2 d；（2）FGF10 组：5 mg/kg FGF10 溶于25 μL PBS 中，连续气道滴注2 d；（3）PM 组：4 mg/kg PM 溶于25 μL PBS 中，连续气道滴注2 d；（4）FGF10+PM组：预先1 h给予5 mg/kg FGF10气道滴注，然后4 mg/kg PM 气道滴注，连续2 d。各组均在末次气道滴注PM 24 h后处死小鼠获取动物标本进行后续实验。

从总资本充足率变化看，中行与工行下降，农行和建行上升，且达到了近年来最高水平。中行降幅较去年同期收窄0.46个百分点，下降情况明显好转；农行得益于外部补充，增幅最大，资本充足率首次超过14%，排名超越中行和工行，跃居第二；建行扭转以往半末下降态势，逆势上升0.14个百分点。

中国古代社会管理是适应小农经济的生产关系以及封建的社会伦理制度而建立起来的一整套社会管控体制。其中，它是主要由以血缘关系为基础的家规、族律，以及体现为非血缘关系的国法构成的一个严密的“三元结构”社会管理体系。

2.2 病理分级 在末次气道滴注PM 24 h后处理动物，经气管插管灌注多聚甲醛填充肺脏，获取完整的肺脏置于多聚甲醛中固定，随后进行石蜡包埋，常规HE 染色后在光学显微镜下进行病理分级评分。以0～4 分的主观等级评估支气管周围和血管周围的炎症程度：0 分为未观察到炎症；1 分为偶见炎症细胞；2 分为气道或血管周围不均匀分布的炎症细胞或炎症细胞围绕成薄的环状（层厚1～5 个炎症细胞）；3 分为气道或血管周围分布均匀的炎症细胞或炎症细胞围绕成厚的环状（层厚＞5 个炎症细胞）；4 分为气道、血管或肺泡分布弥漫聚集的炎症细胞。

动物实验分组造模成功后，收集BALF进行炎症介质检测，ELISA 结果显示，PM 组炎症介质IL-6、IL-8、PGE2和TNF-α 含量较vehicle 组升高，PM+FGF10组炎症介质IL-6、IL-8、PGE2和TNF-α 含量较PM 组降低（P＜0.01），见图2。

2.4 ELISA 实验 获取小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）或细胞培养上清，1 000 r/min、4 ℃离心后获取上清液，ELISA 板中添加标准品和检测样品，37 ℃培养箱孵育2 h后移除ELISA 板每孔中的液体，添加100 μL 的生物素抗体在37 ℃培养箱孵育1 h，再次洗涤去除液体，添加HRP-抗生物素蛋白，37 ℃培养箱孵育1 h，重复洗涤过程5 次，然后显色和终止，利用酶标仪计算每孔吸光度（A），根据标准曲线计算每孔检测样品的浓度。

动物实验分组造模成功后，针对肺组织进行病理分级评分，PM 组气道周围炎症细胞浸润，气道上皮细胞变厚，伴随PM 气道沉积，PM 组病理分级评分较vehicle 组升高，PM+FGF10 组病理分级评分较PM组降低（P＜0.01），见图1A。Western blot 结果显示，PM 组自噬流信号改变，具体表现为LC3-II/LC3-I 比值升高和p62 降解阻滞，PM+FGF10 组自噬流信号发生逆转（P＜0.05或P＜0.01），见图1B。

3 统计学处理

细胞模型分组造模成功后，收集细胞上清液进行炎症介质检测，ELISA 检测结果显示，PM 可以诱导气道上皮细胞炎症介质IL-6、IL-8、PGE2和TNF-α分泌，3-MA 可以逆转PM 诱导气道上皮炎症介质分泌（P＜0.05 或P＜0.01），见图3A～D。与此同时，4 mmol/L 3-MA 预先处理2 h，200 mg/L PM 刺激BESA-2B细胞1 h，Western blot结果显示，PM可以诱导气道上皮细胞NF-κB 通路的改变，具体表现p65 和IκBα磷酸化水平升高，3-MA 可以逆转PM 诱导NF-κB 通路的改变（P＜0.05），见图3E。

作为生肖的老虎，深得中国人欢心。虎年春节请一批虎娃上台虎虎生风地蹦跳，就是一个好节目。但我更倾向于将这些“老虎”形象认定为大猫，因为人们经常是通过猫去想象虎的。真实的老虎无法表现得如此欢乐，它们严肃的表情、稳重的步伐，已经表明它们对待这个世界的基本态度。

结果

1 FGF10 逆转PM 诱导的C57BL/6 小鼠气道炎症和自噬流信号改变

2.5 Westernblot 实验 获取生长状况良好的对数生长期的BEAS-2B 细胞，不同实验干预之后获取细胞，细胞裂解液裂解细胞，4 ℃、20 913×g离心10 min提取上清液，使用BCA 测定蛋白浓度。两组细胞分别取30 μg 蛋白跑凝胶电泳，湿转至PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温下封闭2 h，Ⅰ抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜10 min×3次，Ⅱ抗（1∶5 000）室温孵育1.5 h，再用TBST 缓冲液洗膜10 min×3 次，化学发光法显影条带。

Figure 1. FGF10 reversed PM-induced airway inflammation and autophagic flux change. A：representative images of lung sections with HE staining and the inflammation scores for the images；B：the expression of autophagy-related proteins LC3 and p62 in lung tissues. Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01vs vehicle group；#P＜0.05，##P＜0.01vs PM group.图1 FGF10逆转PM诱导的C57BL/6小鼠气道炎症和自噬流信号改变

2 FGF10 逆转PM 诱导的C57BL/6 小鼠BALF 中炎症介质分泌

2.3 细胞模型的建立 BEAS-2B 细胞使用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640 培养液，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。使用0.25%胰酶溶液进行消化传代，获取生长状况良好的对数生长期细胞。涉及细胞实验，统一使用200 mg/L PM、10 μg/L FGF10 和4 mmol/L 3-MA，其中涉及FGF10/3-MA 和PM 联合处理细胞时，FGF10/3-MA预先1 h处理。具体实验分组如下：vehicle组、FGF10组、PM 组和PM+FGF10 组，检测自噬蛋白LC3 和p62及炎症介质白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达，研究自噬蛋白和炎症介质的表达在FGF10干预下是否存在相关性；vehicle组、3-MA组、PM组和PM+3-MA组，检测炎症介质IL-6、IL-8、PGE2和TNF-α 及NF-κB 信号通路蛋白表达，研究NF-κB 信号通路和炎症介质的表达在3-MA干预下是否存在相关性。

菊芋生长高度在1～3 m不等，秋季开花，花如菊，黄色。叶子是椭圆形，多毛。根茎系统深埋于地下并且比较结实粗壮，叶子互生于茎的顶端，较低的叶子能够长30 cm，长而宽，中央是花头，5.0～7.5 cm，被茎分支下单独生出的侧花包围。多瘤的块茎在地下不均匀生长，其颜色有浅褐色、白色、红色等[1]。

Figure 2. FGF10 reversed PM-induced secretion of inflammatory mediators in the BALF from C57BL/C mice. The levels of inflammatory mediators IL-6（A），IL-8（B），PGE2（C）and TNF-α（D）in BALF were measured by ELISA. Mean±SD.n=3.**P＜0.01vs vehicle group；#P＜0.05，##P＜0.01vs PM group.图2 FGF10逆转PM诱导的C57BL/6小鼠BALF中炎症介质的分泌

3 3-MA 逆转PM 诱导的气道上皮细胞炎症介质分泌及NF-κB通路改变

使用SPSS 20.0 统计软件进行统计分析。数据均以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni 校正的t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

Figure 3. 3-MA reversed PM-induced secretion of inflammatory mediators in culture supernatant from BEAS-2B cells with the change of NF-κB pathway. The BEAS-2B cells were pretreated with 3-MA for 1 h before challenged with PM for 24 h. The levels of inflammatory mediators IL-6（A），IL-8（B），PGE2（C）and TNF-α（D）in culture supernatant were quantified by ELISA.The protein levels of p-p65，p65，p-IκBα and IκBα were determined by Western blot（E）. Mean±SD.n=3.**P＜0.01vs vehicle group；#P＜0.05，##P＜0.01vs PM group.图3 3-MA逆转PM诱导的气道上皮细胞炎症介质分泌及NF-κB通路改变

4 FGF10 逆转PM 诱导的气道上皮细胞炎症介质分泌及自噬流信号改变

10 μg/L FGF10 预先处理BESA-2B 细胞1 h，200 mg/L PM 刺激24 h，ELISA 结果显示，PM 可以诱导气道上皮细胞炎症介质IL-6、IL-8、PGE2和TNF-α分泌，FGF10可以逆转PM 诱导气道上皮炎症介质分泌（P＜0.01），见图4A～D。与此同时，Western blot 结果显示，PM可以诱导气道上皮细胞自噬流改变，具体表现为LC3-II/LC3-I 比值升高和p62 降解阻滞，FGF10 可以逆转PM诱导的自噬流改变（P＜0.05），见图4E。

Figure 4. FGF10 reversed PM-induced secretion of inflammatory mediators in culture supernatant from BEAS-2B cells with the change of autophagy-related proteins LC3 and p62. The BEAS-2B cells were pretreated with FGF10 for 1 h before challenged with PM for 24 h. The levels of inflammatory mediators IL-6（A），IL-8（B），PGE2（C）and TNF-α（D）in culture supernatant were quantified by ELISA. The expression of autophagy-related proteins LC3 and p62 was determined by Western blot（E）. Mean±SD.n=3.**P＜0.01vs vehicle group；#P＜0.05，##P＜0.01vs PM group.图4 FGF10逆转PM诱导的气道上皮细胞炎症介质分泌及自噬流信号改变

讨论

空气污染是我国目前严重危害健康的公共卫生问题，作为空气污染物中固态颗粒状物质和液态颗粒状物质的总称，PM 可以随呼吸气流广泛沉积于气道或肺泡［10］。PM 短时暴露导致的呼吸道炎症效应包括气道-肺泡炎症，在呼吸系统疾病（包括慢性气道疾病和肺恶性肿瘤等）发生发展中扮演了始动角色［11］。针对PM 短时暴露的呼吸道炎症效应在呼吸系统疾病发生发展中的始动角色，结合目前文献围绕细胞自噬在PM 的诱导气道炎症中的作用以及FGF10 在支气管-肺上皮损伤后的修复作用，本文拟深入研究自噬流在PM 诱导的气道炎症中的变化及FGF10 是否通过调控自噬流发挥抗炎效应。由于临床上难以获取PM 短时暴露下的人体肺组织，我们使用PM 连续2 d 气道滴注的动物模型，造模方法参考已发表的文章［12］。获取动物肺组织进行病理分级评分，发现PM 气道滴注可以导致肺组织以气道炎症为主的病理改变，具体包括气道PM 沉积和气道周围炎症细胞浸润，而肺泡腔内无明显的炎症细胞渗出。PM 按其空气动力学直径，可以广泛沉积于气道-肺泡［13］，以上实验结果可能与气道滴注的实验方式相关，因为PM 气道滴注难保证PM 沉积到气道终末的肺泡，在后续的研究中设计雾化方式可能会更加贴合临床实践。在PM 气道滴注动物模型中，预先气道滴注FGF10干预可以缓解PM 诱导气道炎症，肺组织病理分级评分降低。与肺组织病理分级评分一致的是，BALF 中炎症介质IL-6、IL-8、PGE2和TNF-α 的分泌变化。无论是肺组织病理分级评分或是炎症介质的分泌，给予额外FGF10 可以补充肺损伤情况下自分泌FGF10的含量，发挥抗炎保护作用。至于PM 短时暴露下自噬水平的变化，我们发现LC3-II和p62蛋白表达水平升高，LC3-II/LC3-I 蛋白比例升高，而FGF10 干预可以逆转自噬流的变化。已知自噬涉及自噬诱导发生及自噬泡生成、自噬溶酶体生成和自噬溶酶体降解3个主要环节［6］。本研究中LC3-II/LCI 蛋白比值和p62 蛋白水平升高，说明PM 诱导自噬流紊乱，表现为PM 诱导自噬发生而自噬降解阻断，与Zhao等［14］报道的超细颗粒物诱导肺泡上皮细胞自噬流紊乱的结果相似。伴随着FGF10可以逆转自噬流紊乱，推测FGF10主要作用在PM 诱导自噬发生的核心环节。肺泡上皮的自噬流紊乱是肺纤维化重要的病理生理过程［6］，而肺组织自噬在PM 诱导的气道炎症中的作用仍待深入研究。自噬具有双重性，一定程度的自噬可以维护气道上皮的稳定，而持续刺激下过度的自噬可以介导气道上皮的损伤［15］。

PM 短时暴露诱导气道炎症时，气道上皮细胞在气道炎症中扮演启动细胞和继发受体，于是在研究自噬与气道炎症的分子机制研究方面我们使用了人正常气道上皮细胞。实验结果表明，自噬抑制剂3-MA 可以逆转PM 诱导的气道上皮细胞炎症介质分泌，与Zhu 等［16］的基因芯片发现PM 可以诱导自噬相关蛋白表达的结果一致。炎症介质的分泌与NF-κB通路密切相关，我们亦发现3-MA 可以逆转PM 诱导的NF-κB 通路中p65 和IκBα 磷酸化水平的变化，推测自噬/NF-κB 通路参与PM 诱导的气道炎症。与动物实验相似的是，细胞实验中FGF10 干预可以逆转PM 诱导的炎症介质IL-6、IL-8、PGE2和TNF-α 分泌，伴随自噬相关蛋白LC3-II/LC-I 蛋白比值和p62 蛋白表达的变化。自噬抑制剂3-MA 主要经抑制自噬体生成，结合FGF10逆转PM 诱导的LC3-II/LC-I蛋白比值和p62 蛋白表达变化，推测FGF10 在调控自噬方面的作用机制与3-MA 作用靶点相似，主要在自噬体生成方面。综合以上结果，我们率先发现了FGF10在PM 诱导的气道炎症中经调控自噬流而发挥抗炎作用，为FGF10 在气管-肺上皮损伤修复中的作用阐明了新的分子机制。考虑到PM 短时暴露导致气道炎症时并未发生气道重构等结构性改变，炎症损伤具有一定的可逆性，而间充质来源的FGF10 介导间充质细胞与上皮信号之间的信号传导本身即是机体的自我稳态维持机制［17］。再考虑到在PM 持续暴露下机体自我修复能力的局限，给予重组FGF10 可以补充间充质来源的FGF10 的不足，为后续重组FGF10的临床转化提供了思路。

目前围绕FGF10 在PM 诱导气道炎症中的抗炎效应方面的研究处于起步阶段。我们之前研究发现FGF10 经调控HMGB1 的胞核胞浆转移而发挥抗炎效应［18］，而本研究率先证实了FGF10 通过调控自噬流在PM 诱导的气道炎症中发挥抗炎效应。然而整个研究中尚存在较多的不足之处：首先，动物实验PM 气道滴注的实验方法虽然目前被广泛使用，但PM 气道滴注不能完全模拟PM 暴露呼吸道吸入的过程，PM 气道滴注的动物模型以气道炎症损伤为主，后续的研究中使用PM 雾化吸入的方法可能更为妥当；其次，在PM 诱导自噬流变化方面，无论是动物实验或是细胞实验，仅是检测了两个自噬相关蛋白LC3 和p62，没有继续研究自噬体生成、溶酶体降解等自噬紊乱过程，需要更深层次的研究以寻找更多可以干预的靶点；最后，在自噬紊乱和炎症反应之间，本研究证实了FGF10 可以逆转自噬紊乱和炎症反应，3-MA 可以逆转PM 诱导的NF-κB 通路活化，在FGF10 和自噬/NF-κB 通路信号之间需要涉及更多的分子机制实验来阐明。

综上所述，本研究从动物实验和细胞实验两个层面揭示了FGF10 在PM 诱导的气道炎症中发挥抗炎效应，其中分子机制涉及自噬/NF-κB通路，揭示了间充质来源的FGF10 参与气道上皮修复的崭新机制，为后续FGF10针对PM 相关呼吸道炎症的成药性提供了实验依据。